大豆異黃酮對心理應激所致小鼠卵巢氧化損傷的保護作用

肖衛榮 ，袁照清 ，余玉珍 ，徐良全 ，鄒文斌

（1.豐城市婦幼保健醫院婦產科，江西 豐城 331100；2.萬載縣中醫院婦產科，江西 萬載 336100；3.南昌大學醫學實驗教學部，南昌 330006；4.豐城市人民醫院醫務科，江西 豐城331100）

卵巢儲備功能是指卵巢內存留卵泡的數量和質量，能反映女性的生育潛能和生殖內分泌功能。卵巢儲備功能下降（decreasing ovarian store，DOS），可導致女性生育能力減弱及性激素缺乏，進一步發展為卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）。近年來，隨著社會經濟、文化、生活環境、工作節奏等的改變，DOS發病率有逐年上升趨勢，嚴重影響著女性的生殖健康和生活質量。以往研究[1-2]表明，應激可以通過影響內分泌從而影響生殖功能。至于長期心理應激條件下，是否會導致卵泡細胞的氧化損傷，國內外均未見報道。本研究通過建立動物的應激模型，并進行大豆異黃酮（soy isoflavones，SI）干預處理。同時，通過測定小鼠卵巢中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物（glutathione peroxi-dase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的變化，探究心理應激對卵巢氧化損傷作用及其損傷機制，明確心理問題對女性生殖健康的影響，為婦女更年期的推遲及卵巢早衰的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取剛剛性成熟的健康雌性昆明小鼠50只，體質量18～22 g，由南昌大學實驗動物中心提供。喂養普通飼料，自由飲水。動物房溫度控制在（24±1）℃，濕度為 40%～70%，光∶暗周期為 12 h∶12 h。適應喂養3 d后，按隨機數字表法分為5組：對照組、應激模型組、SI低劑量組 （83 mg·kg-1）、SI中劑量組（167 mg·kg-1）和 SI高劑量組（333 mg·kg-1），每組 10 只小鼠。SI組應激的同時給與SI處理。SI各組每日按2%（即 2 mL·100 g-1）給予相應劑量的 SI，用 0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成混懸液灌胃；應激模型組和對照組每日給予等體積0.5%CMC-Na溶液灌胃。連續30 d。

1.2 心理應激動物模型的建立

參照文獻[3]的方法，SI組及應激模型組小鼠以束縛為應激原建立心理應激動物模型。使用50 mL離心管（圖1），在離心管管壁前端扎數個孔，保證空氣通暢。在離心管蓋子上鉆孔，待小鼠鉆入離心管后，蓋上離心管蓋子，將小鼠尾部暴露在外面，封閉后的離心管固定于水平桌面上。每天09:00開始，15:00解除，束縛持續30 d。

1.3 檢測指標及方法

圖1 束縛應激模型

1.3.1 血清皮質醇測定

在末次束縛應激24 h后，取小鼠眼眶血分離血清，采用皮質醇放射免疫分析測定盒（北京四環生物技術有限公司）檢測血清中的皮質醇含量。

1.3.2 SOD、GSH-Px活性和 MDA含量測定

分別摘取各組小鼠卵巢。稱重后，按1∶9的比例與冷生理鹽水混合，制成10%的勻漿。離心后，取上清液，按試劑盒（南京建成生物工程研究所)要求測定SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠血清皮質醇分泌的變化

應激模型組及SI低劑量組皮質醇水平明顯高于對照組（均P＜0.05)；與對照組相比，SI中高劑量組皮質醇雖然有升高，但是差異無統計學意義（P＞0.05），SI各劑量組血清皮質醇較應激模型組低（P＜0.05），其中SI中劑量皮質醇水平降低最明顯。見表1。

2.2 各組小鼠卵巢SOD、GSH-Px活性及MDA含量的變化

各應激組小鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px活力均低于對照組，MDA含量均高于對照組（均P＜0.05）；與應激模型組相比，SI各劑量組小鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px 活力均明顯升高（均 P＜0.05），MDA 含量均明顯降低（均P＜0.05），其中以SI中劑量組效果最為明顯。見表1。

表1 各組小鼠血清皮質醇水平及卵巢SOD、GSH-Px活性和 MDA含量的變化 ±s

表1 各組小鼠血清皮質醇水平及卵巢SOD、GSH-Px活性和 MDA含量的變化 ±s

*P＜0.05與對照組比較，△P＜0.05與應激模型組比較，#P＜0.05與SI中劑量組比較。

MDA/（nmol·mgprot-1）對照組 10 257.26±1.51 175.86±13.51 126.86±8.65 0.356±0.05應激模型組 10 275.86±1.21* 136.43±12.21* 78.24±12.15* 0.615±0.03*SI低劑量組 10 270.16±1.21*△ 148.79±15.21*△# 89.02±6.82*△# 0.515±0.08*△#SI中劑量組 10 259.47±1.48△ 169.56±10.23*△ 115.35±8.65*△ 0.337±0.12*△SI高劑量組 10 263.02±1.23△ 156.14±15.48*△# 94.36±8.65*△# 0.428±0.13*△#組別 n 血清皮質醇ρ/（ng·mL-1）SOD/（NU·mgprot-1）GSH-Px/（活力單位·mgprot-1）

3 討論

心理社會因素是現代社會中重要的應激源。長期應激時，下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）持續激活，皮質醇大量釋放。同時，交感神經系統（SNS）興奮，交感神經末梢和腎上腺髓質釋放兒茶酚胺增加，導致機體的穩態失衡。另外，應激條件下產生的許多活性氧和自由基，對組織細胞產生不可逆的氧化應激損傷。

氧自由基，統稱為活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS是需氧生物在自身的新陳代謝過程中，由于受到內外環境的刺激而在其機體內持續產生的活性產物，包括超氧陰離子（O2-·）、羥自由基（OH·）、氫過氧化物（H2O2）及單線態氧等。 ROS 因含有未成對電子,所以極不穩定,容易與其鄰近分子反應，并可誘發產生新的自由基，一般情況下可以參與機體的物質代謝和信號轉導，對細胞的正常代謝起著重要作用。ROS的產生會受到體內抗氧化防御系統的調節，從而保持在平衡的健康狀態。當自由基產生過多或自由基通過內源性的抗氧化成分進行清除減少，如SOD和GSH-Px等出現故障，體內氧自由基代謝就會出現失衡，導致自由基蓄積過多，攻擊機體，則對組織細胞產生不可逆損傷，氧化應激即發生,造成蛋白質損傷、脂質過氧化、DNA改變、酶失活等,發生包括癌癥、心血管疾病、風濕性關節炎、感染等多種病變[4-5]。

最近的研究發現，心理應激可以導致卵巢儲備功能下降[6]，其可能的機制是否與氧化應激損傷有關呢？本實驗研究證實了筆者的設想，實驗中發現各應激組小鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px活力均較對照組明顯偏低，MDA含量較對照組明顯升高，說明應激可以導致小鼠卵巢的氧化損傷。

SI是從大豆中分離提取的一類多酚化合物，具有防癌、抗衰老、抗氧化、防治骨質疏松、調節細胞的基因表達及抑制細胞凋亡等作用[7-11]，主要包括大豆黃酮、大豆黃酮甙、染料木素和染料木甙。SI與內源性雌激素有相似的分子結構,能與雌激素α、β 2 種受體（Erα、Erβ）結合，發揮雌激素樣作用[12]。 本實驗中發現，應激的同時給予SI干預，其血清皮質醇水平明顯降低，其機制就是SI具有擬雌激素的作用，通過直接或間接影響HPA功能，維持內環境的穩定，從而抑制皮質醇的釋放。另外，SI的各主要成分均是天然抗氧化劑，能刺激抗氧化酶合成并增加其活性。同時，清除體內活性氧自由基、減少脂質過氧化物的產生。體內外實驗[13-15]均表明，SI能夠通過直接清除活性氧和間接的抗氧化作用使心肌細胞培養基中的MDA含量降低。J.S.Lee[16]發現，染料木黃酮可以顯著提高糖尿病大鼠肝臟抗氧化酶包括SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性。C.Borras等[17]用染料木黃酮孵育人乳腺瘤細胞系（MCF-7）48 h，發現該細胞的 Mn SOD mRNA 含量顯著增高。SOD的唯一生理功能是歧化 O2-·，它可以促進 O2-·的歧化反應，清除O2-·的毒性作用，減輕和防止脂質過氧化作用，SOD活性增強可以保護細胞不受自由基的損害。本研究發現：與應激模型組相比，SI各亞組小鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px活力均明顯升高，MDA含量均明顯降低。表明SI可以對抗或降低應激所致的小鼠卵巢的氧化損傷。

總之，SI所具有的抗氧化作用能淬滅體內異常增多的自由基、減少脂質過氧化產物、增加抗氧化酶的活性，具有很好的開發價值。

本實驗系在南昌大學醫學院生殖研究所內完成，并得到南昌大學醫學院徐良金老師的大力指導，在此表示感謝！

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