輕度腦震蕩大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的研究

章升國，熊進(jìn)挺，曾斌華，王新剛，余振興，鄧培剛

（南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南昌 330003）

在現(xiàn)代化社會，隨著交通工具的發(fā)展，重、中、輕型顱腦損傷日益多見。但是輕型顱腦損傷研究還是處于初步階段，對腦震蕩（CC）發(fā)病機(jī)制、神經(jīng)細(xì)胞的死亡及凋亡認(rèn)識尚不完全清楚。細(xì)胞凋亡（apoptosis）概念的提出在生命科學(xué)領(lǐng)域研究中已引起人們極大的興趣，有關(guān)細(xì)胞凋亡在顱腦損傷機(jī)制中的研究也日益增多。本研究利用鐵錘單擺致傷儀打擊大鼠制作輕度腦震蕩模型，采用TUNEL（TdT mediated dUTP niekend labeling）法檢測大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、主要儀器和試劑

SD 大鼠 100 只，體質(zhì)量（280±20）g，月齡 2～3 個(gè)月，昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所提供。鐵錘單擺致傷儀（昆明醫(yī)學(xué)院）；顯微鏡（日本日立公司）；超薄切片機(jī)（瑞士LKB公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國 Roche公司提供）。

1.2 分組與動(dòng)物模型制作

分組：將100只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，每組50只。制模：用鐵錘單擺致傷儀對實(shí)驗(yàn)組SD大鼠額頂部行1次鈍性打擊，復(fù)制具有一過性腦功能障礙的腦震蕩大鼠，大鼠腦震蕩的判斷標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)[1]標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 TUNEL法檢測

采用TUNEL法檢測2組SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況。在實(shí)驗(yàn)組制模后（傷后）6 h，1、2、4、8 d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)處死2組SD大鼠各10只。動(dòng)物經(jīng)過灌注、取材、冰凍、切片后參照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試測盒說明漂洗、孵化、DAB染色。海馬區(qū)結(jié)構(gòu)各隨機(jī)選取視野，顯微鏡下觀察每個(gè)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于對照組（P<0.01），對照組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組傷后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量逐步上升，至傷后2 d達(dá)高峰，然后逐步下降，凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)傷后2 d與傷后6 h、8 d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

表1 2組細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)比較 ±s，個(gè)

表1 2組細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)比較 ±s，個(gè)

*P<0.01與對照組同時(shí)段比較；﹟P<0.01與實(shí)驗(yàn)組6 h、8 d比較。

組別 n 6 h 1 d 2 d實(shí)驗(yàn)組 10 7.68±1.81* 15.14±1.79* 20.26±2.97*﹟對照組 10 1.36±0.28 1.38±0.42 1.46±0.51 4 d 13.42±1.75*1.42±0.62 8 d 8.82±0.88*1.35±0.98

實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)傷后經(jīng)DAB染色，見棕黃色大小不一、結(jié)構(gòu)不清的細(xì)胞凋亡。傷后6 h、1 d可見細(xì)胞核固縮，細(xì)胞萎縮，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu)，示細(xì)胞凋亡。傷后2、4、8 d細(xì)胞器消失，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)萎縮，呈現(xiàn)凋亡小體，這時(shí)細(xì)胞凋亡發(fā)生改變，染色質(zhì)濃縮成塊狀，有胞質(zhì)濃縮，胞體皺縮，細(xì)胞體積減小，形狀不一的細(xì)胞凋亡小體，提示腦震蕩后海馬區(qū)有細(xì)胞凋亡（圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)DAB染色（傷后2 d）

3 討論

細(xì)胞凋亡的概念最早由 J.F.Ker等[2]提出，A.Rink等[3]證實(shí)在創(chuàng)傷性腦損傷后存在神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，此后有關(guān)細(xì)胞凋亡在顱腦損傷中的作用與意義日益受到重視，為顱腦損傷后凋亡的啟動(dòng)與調(diào)控及抗凋亡治療研究提供了理論依據(jù)。A.Rink等[4]證明創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）后出現(xiàn)的凋亡現(xiàn)象是腦細(xì)胞死亡的一種重要方式，TBI后6 h，細(xì)胞凋亡即可出現(xiàn)，24～72 h達(dá)高峰；輕度TBI后，腦皮層凋亡高峰期在傷后1 d，齒狀核為1～2 d，白質(zhì)和海馬區(qū)則為2～3 d；中度損傷后，凋亡的高峰期皮層為3 d，且有明顯的持續(xù)上升趨勢，海馬、齒狀核在傷后12 h～3 d持續(xù)保持在一定水平，白質(zhì)為2～3 d。大鼠腦創(chuàng)傷后誘發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙，在齒狀回顆粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，表明凋亡是腦創(chuàng)傷記憶障礙的原因之一[5]。彌漫性腦損傷后24 h，海馬的CAZ-4區(qū)和齒狀回可見凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，7 d時(shí)達(dá)到高峰，同時(shí)伴明顯的空間學(xué)習(xí)記憶功能的損傷[6]。大鼠視神經(jīng)軸索損傷后，視網(wǎng)膜出現(xiàn)視神經(jīng)元凋亡，1～3 d陸續(xù)出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，5 d達(dá)到高峰[7]。TBI患者的大腦中TUNEL檢查可顯示凋亡細(xì)胞，此進(jìn)一步證實(shí)凋亡在腦創(chuàng)傷后腦損傷的作用意義[8]。凋亡是一種在基因調(diào)節(jié)下進(jìn)行的細(xì)胞主動(dòng)死亡方式。凋亡現(xiàn)象廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS），不僅參與CNS的正常發(fā)育過程，在退行性疾病(如阿爾茲海默氏病、帕金森氏病)和腦缺血性損傷中，凋亡扮演重要的角色。近年研究表明，創(chuàng)傷性腦損傷后凋亡參與了腦細(xì)胞死亡的機(jī)制[9]。

本研究采用鐵錘單擺致傷儀打擊大鼠額部，大鼠腦震蕩后出現(xiàn)繼發(fā)性腦水腫，輕度缺血缺氧等病理反應(yīng)，繼發(fā)性損傷因素隨之產(chǎn)生，可激活細(xì)胞促凋亡基因和（或）抑制凋亡抑制基因的活性，誘發(fā)細(xì)胞凋亡發(fā)生。本研究采用TUNEL檢測細(xì)胞凋亡試劑盒來檢測大鼠腦震蕩后細(xì)胞凋亡的發(fā)生變化，結(jié)果顯示,對照組幾乎無凋亡細(xì)胞存在,實(shí)驗(yàn)組存在不同程度的細(xì)胞凋亡，于傷后6 h即可出現(xiàn)細(xì)胞的凋亡，1 d和2 d達(dá)高峰，4 d和8 d略有下降，與以往中、重型顱腦損傷（3～4 d達(dá)高峰期，持續(xù) 7～8 d甚至10 d高峰期，而后逐步減退）比較，輕度腦震蕩后細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量相比中、重型顱腦損傷較少。

[1] 于建云,李俊祥,郭澤云,等.實(shí)驗(yàn)大鼠輕中型閉合性腦損傷昏迷指標(biāo)與分級標(biāo)準(zhǔn)[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（1）：8-11.

[2] Ker J F，Wyllie A H，John A G,et al.failure of Pselectin blockade alone to protect the liver from ischemiareperfusion injury in the isolated blood-perfused rat liver[J].Grastroenterol，2008，14（44）：6808.

[3] Rink A,Fung K M，Trujanouahi J Q，et al.D1 dopamine receptor immunoreactivity in human and monkey cerebral cortex：predominantand extrasynaptic localization in dendritic spines[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，91（12）：5720-5724.

[4] Rink A，Alexander K.Regulation of depotentiation and long-term potentiation in the dentate gyrus of freely moving rats by dopamine D2-like receptors[J].Cerebral Cortex，2009，13（2）：123-135.

[5] De Keyser J，De Backer J P，Vauquelin G，et al.The effect of aging on the D1 dopamine receptors in human frontal cortex[J].Brain Res，2006，528（2）：308-310.

[6] Hong J，Cui J，zhou Y，et al.Study on coguition disouder and morphologic change of neutous in hippocampus area following tranmatic brain injury in rat[J].Chin Tranmatol，2002，5（1）：36-39.

[7] 孫曉川，盧海濤，鄭履平，等.彌漫性軸索損傷對神經(jīng)元影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].創(chuàng)傷外科雜志，2003，5（6）：426-428.

[8] Smith J W,Fetsko L A，Xu R，et al.Dopamine D2L receptor knockout mice display deficits in positive and negative reinforcing properties of morphine and in avoidance learning[J].Neuroscience，2009，113（4）：755-765.

[9] 楊云華，廖維宏.腦創(chuàng)傷后細(xì)胞凋亡及其基因調(diào)控[J].創(chuàng)傷外科雜志，2004，6（6）：462-464.