鎘脅迫下的桑樹幼苗葉片丙二醛含量動態分析

覃勇榮，馮濟梅，梁文忠，李秋明，劉旭輝

(河池學院化學與生命科學系，廣西宜州546300)

鎘脅迫下的桑樹幼苗葉片丙二醛含量動態分析

覃勇榮，馮濟梅，梁文忠，李秋明，劉旭輝

(河池學院化學與生命科學系，廣西宜州546300)

采用水培試驗方法，分別研究了不同濃度重金屬鎘脅迫背景下，添加或不添加EDTA處理的桑苗葉片丙二醛含量45 d的動態變化。實驗結果表明:(1)桑苗葉片的丙二醛含量與鎘濃度有關，在21 d～27 d內，丙二醛含量呈波動上升趨勢，之后呈波動下降趨勢;(2)與不添加EDTA的對照組比較，加入EDTA處理的桑苗葉片丙二醛含量波動比較平緩，隨鎘脅迫時間的增加，其葉片中的丙二醛含量緩慢增加;(3)低濃度的鎘離子對桑苗生長有一定的促進作用，但濃度較高時會對其造成一定的傷害，使其生長受到抑制，葉片變黃，萎蔫，甚至死亡;(4) EDTA能適當緩解鎘離子對桑苗的傷害。

桑樹幼苗;重金屬;鎘脅迫;丙二醛含量

廣西礦產資源豐富，享有“有色金屬之鄉”的美譽。過去，由于資金缺乏或者技術落后，礦業開發不可避免地對周邊環境造成一定的影響。近年來，隨著東桑西移及農業產業結構的調整，廣西已成為我國重要的桑蠶種養基地。但是，礦區及其周邊環境重金屬污染的風險依然存在。殘留于土壤中的重金屬元素可參與到水體—土壤—生物的系統循環，也可以通過植物的吸收或動物的取食進入食物鏈，從而影響農業生產和生態系統的安全［1－3］。所以，篩選抗性強、適應性廣的高產優質桑樹品種，對廣西桑蠶產業的可持續發展具有重要意義［4］。

鎘是一種有毒的重金屬，也是自然界的一種主要污染源，鎘脅迫嚴重影響植物的生長發育，降低作物的產量和質量［5］。研究表明，高濃度的鎘能誘導過量活性氧的產生，破壞細胞的氧化還原狀態和細胞膜的穩定性，干擾細胞的正常代謝［6］，鎘在土壤中的高毒性更令人擔憂［7］。

螯合劑對金屬離子有很強的螯合能力，能增大土壤中重金屬的溶解度，促進重金屬在植物地上部的積累。近年來，利用螯合劑輔助植物提取的技術(Chelate－assistedphyto－extraction)備受青睞。陳亞華等人研究發現，游離態的Pb或EDTA對幼苗具有毒害作用，而螯合態的Pb－EDTA基本不具有生物毒性［8，9］。可見，在適當濃度的EDTA作用下，重金屬對植物的生理脅迫可能會有一定程度的緩解。因為植物對重金屬脅迫有一定的耐性，同時也會產生一定的抗逆性。所以，了解植物對重金屬脅迫的抗逆機理、耐受重金屬的濃度范圍及產生適應性所需時間，可以在重金屬污染的土壤篩選合適的修復植物，或者種植耐性較強、經濟價值較高的作物，充分利用有限的土地資源，發揮最大的生態經濟效益。

關于重金屬污染對植物影響的相關研究，大多集中在探討植物對重金屬的吸收、轉運、累積，以及重金屬對植物光合作用和呼吸作用的影響等方面。關于鎘對小麥、玉米等作物生長發育及其生理生化影響的研究相對較多［10－12］，而關于重金屬對桑蠶的生長、產量及毒性機理等方面的研究報道甚少，關于鎘等重金屬對廣西桑蠶產業影響的研究亦鮮有報道［13］。以桑樹幼苗為實驗材料，采用水培方法，模擬不同濃度的重金屬鎘脅迫，采取添加或者不添加螯合劑EDTA兩種不同的處理方式，分析不同濃度重金屬鎘脅迫背景下，桑樹幼苗葉片MDA含量隨時間動態變化的特征，可以了解桑樹幼苗的受害過程及機理，為減輕鎘等重金屬對桑樹的危害，提高桑蠶及相關產業的經濟效益提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究的實驗材料——桑樹幼苗品種為特優二號，苗齡45d，由廣西宜州市城南廣場桑苗批發部提供，均未受到有害物質的污染。

1.2 儀器與試劑

實驗儀器:AL204型電子分析天平(梅特勒—托科多儀器上海有限公司);80－2型臺式電動離心機(常州國華電器有限公司);CFA－160型微電腦光波電熱爐(茂名市恒聲電器有限公司);722N型可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);101－2－BS型臺式恒溫干燥箱(上海躍進醫療器械廠);UV－1800型紫外－可見分光光度計(上海:島津國際貿易有限公司);艾柯DZG－303A型純水儀(臺灣艾柯成都康寧試驗專用純水設備廠);華燁HYP－1040型四十孔消化爐﹙上海纖檢儀器有限公司﹚;pHS－3C型pH計(上海精密科學儀器有限公司);FZ－102型微型植物樣品粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

主要試劑:Cd(NO3)2、EDTA、Ca(NO3)2、ZnSO4、KNO3、(NH4)3PO4、MgSO4、Fe3+、微量元素。鎘標準液、二甲酚橙、六亞甲基四胺、無水乙醇、乳化劑OP、磷酸二氫鈉、硼砂、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、2－硫代巴比妥酸(2－thiobarbituric acid，TBA)。

以上試劑除2－硫代巴比妥酸(C4H4N2O2S)為生化試劑(BR)外，均為分析純(AR)，實驗用水為去離子水。

1.3 實驗方案

1.3.1 材料處理

選擇外觀大小、規格基本一致的健壯桑苗，先用清水把根部的泥沙洗滌干凈，然后用KMnO4溶液浸泡10min，再用去離子水清洗干凈，備用。

1.3.2 水培試驗

用盆栽模擬法［14］，以4L/盆Hoagland營養液作為培養液，設不同Cd2+濃度處理，以不添加EDTA的桑樹幼苗水培試驗作對照。因為高濃度的重金屬離子脅迫很快會使桑苗死亡，所以，根據筆者前期進行的預備實驗結果并參考有關文獻，水培液中的Cd2+濃度分別設為0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0mg/L，EDTA的濃度均為0.55mmol/L。重金屬Cd2+用Cd(NO3)2配制，Cd2+濃度以純金屬離子計算［15，16］。加入重金屬Cd2+后，以3d為一個時間間隔，分別取樣測定桑樹幼苗基部葉片的丙二醛含量。培養幼苗時，每種不同的實驗處理均設三個重復，以保證樣品測試時材料的供應和數據的可靠性。

1.3.3 丙二醛及鎘含量的測定

(1)丙二醛含量的測定用硫代巴比妥酸法［17］。

(2)鎘含量的測定用HNO4－HClO4消化，二甲酚橙分光光度法［18］，實驗材料為培養45d的桑樹幼苗。

1.3.4 數據處理

數據處理用Microsoft Excel 2003和SPSS18.0軟件進行，每個樣品均做三個平行測定，結果取平均值。利用單因子方差分析(one－way ANOVA)和最小顯著差數法(LSD)，對不同樣品的測定數據進行比較和差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的Cd2+對桑樹幼苗葉片丙二醛含量的影響

圖1為水培液中不添加EDTA時，桑樹幼苗在各種不同濃度Cd2+脅迫的情況下，其葉片丙二醛含量的測定結果。由圖1可看出，隨著Cd2+濃度的升高，丙二醛含量呈上升趨勢。加重金屬鎘6d后，丙二醛含量明顯低于3d后的含量，可能是桑樹幼苗對重金屬鎘脅迫產生生理抗逆性的結果。在加入Cd2+后的21～27d時間內，大部分桑樹幼苗葉片的丙二醛含量呈逐漸上升趨勢，之后變化較平緩，說明桑苗在經歷重金屬鎘脅迫一段時間后，有了一定的有適應性。加入Cd2+濃度為250、200、150、100、50mg/L脅迫處理的桑苗，分別在第12d、30d、30d、30d、36d摘不到葉子，說明隨著重金屬離子濃度的增高，鎘對桑樹幼苗的生長產生了明顯的抑制作用。通過每天的觀察記錄得知:隨著Cd2+濃度提高和時間的推移，桑樹幼苗葉片褪綠、變黃、枯槁及萎蔫的現象越明顯，因此也越難長成葉子，甚至一些幼苗逐漸出現死亡癥狀。從桑樹幼苗丙二醛含量的分析結果來推斷，低濃度的Cd2+可能對桑樹幼苗的生長有一定的促進作用，但高濃度的Cd2+對桑樹幼苗生長卻能產生明顯的毒害作用。

圖1 不同濃度的Cd2+對桑樹幼苗葉片丙二醛含量的影響

2.2 EDTA對鎘脅迫下的桑樹幼苗葉片丙二醛含量的影響

圖2為水培液中添加EDTA時，桑樹幼苗在各種不同濃度Cd2+脅迫下，其葉片丙二醛含量的測定結果。由圖2可看出，加入EDTA的桑樹幼苗在重金屬Cd2+的脅迫下，隨著時間的推移，其葉片中的丙二醛含量稍有上升。通過對圖1和圖2的比較可知，前者丙二醛含量大多為0.015μmol/g左右，而后者的丙二醛含量則大多在0.015μmol/g之下。空白對照組與單獨加EDTA的實驗處理組相比，加EDTA處理組的丙二醛含量明顯高于空白對照組。

圖2 EDTA對鎘脅迫下的桑樹幼苗葉片丙二醛含量的影響

2.3 桑樹幼苗葉片丙二醛含量與其體內Cd2+含量的關系分析

圖3為不添加EDTA水培45d，桑苗葉片丙二醛含量與桑苗中鎘含量的比較。可見，桑樹幼苗的鎘含量隨著培養液中的Cd2+濃度增大而逐漸升高，丙二醛含量與桑樹幼苗吸收的鎘成正相關(r=0.83，p＜0.01)。當培養液中Cd2+為250mg/L時，隨著桑樹幼苗對鎘離子吸收的增加，MDA含量卻明顯下降，其原因有待研究。

圖3 桑苗葉片丙二醛含量與桑苗吸收Cd2+的情況比較

2.4 EDTA處理對桑苗葉片丙二醛含量及其體內Cd2+含量的關系分析

圖4為添加EDTA水培45d，桑苗葉片丙二醛含量與桑樹幼苗中鎘含量的比較。值得注意的是，在培養液中的Cd2+濃度為200mg/L時，桑苗對鎘離子吸收量最大(此時其桑苗葉片中的丙二醛的含量也達到一個峰值)，說明桑樹幼苗對重金屬鎘的吸收是一個十分復雜的過程，許多問題尚有待進一步研究。

圖4 添加EDTA處理對桑苗葉片丙二醛含量及其體內吸收Cd2+的影響

3 討論

植物生理生化研究結果表明，植物細胞損傷過程中，生物膜的破壞是由細胞產生的超氧自由基誘導脂質中的不飽和脂肪酸發生過氧化作用造成的［19］。丙二醛的積累來自不飽和脂肪酸的降解，它的生成是植物體內自由基引發而產生的，丙二醛的積累能夠反映植物體內自由基的活動狀態［20］。因此，在植物逆境生理研究中，丙二醛被普遍地作為一種表示傷害的指標。在本試驗中，在重金屬鎘脅迫下，隨著水培液中的Cd2+濃度升高，桑樹幼苗葉片細胞損傷程度增加，丙二醛含量增多。高濃度的Cd2+脅迫，桑苗受害嚴重，甚至死亡。本實驗的結果與鄭世英、鄭愛珍等相關研究的結果相一致［21，22］。由本試驗結果可知，單獨加EDTA對植物細胞也有一定損害。在重金屬離子存在的情況下，加入EDTA能促進了桑苗對鎘的吸收，鎘與EDTA螯合，可降低其對桑樹幼苗的毒害作用，這與陳亞華等對螯合態的Pb－EDTA作用于油菜幼苗的結果相似［8，24］。一般情況下，植物吸收的重金屬主要積累在根部，然而這種現狀也會受到重金屬濃度的限制，隨著重金屬處理濃度的升高，重金屬離子在其體內積累量逐漸增加，從而對植物的毒害作用加劇，重金屬脅迫使植物細胞內產生活性氧自由基超過保護酶系統的清除能力時，就會導致自由基在葉細胞內的大量積累，從而誘導對植物細胞的過氧化傷害［23］。這也表明重金屬脅迫條件下，植物體內活性氧清除系統對植物細胞的保護作用是有限度的。本研究發現，桑樹幼苗對重金屬Cd2+具有一定的耐性，在桑苗培養的過程中，在一定的濃度范圍內，桑樹幼苗能夠耐受脅迫，生長良好，很少死苗現象。至于桑樹幼苗對其他重金屬離子脅迫的抗逆機理，以及EDTA對其他重金屬毒害是否也有降解作用，目前還不甚明了，有待進一步研究。

4 結論

根據實驗研究結果及以上分析討論，可以初步得到以下結論:

(1)桑樹幼苗對重金屬鎘具有一定的耐性。但是，在Cd2+的脅迫下，桑樹幼苗細胞膜受損，丙二醛含量升高。(2)低濃度的Cd2+對桑樹幼苗生長有一定的促進作用，但Cd2+濃度大于50mg/L時，對桑苗生長有毒害作用。(3)桑樹幼苗對Cd2+的吸收是一個復雜的過程，其葉片中的丙二醛含量及體內的Cd含量并非與水培液中的Cd2+濃度成正相關，但是，其葉片中的丙二醛含量與莖葉中的鎘含量成正相關。(4)EDTA促進了桑苗對Cd2+的吸收，對緩解重金屬鎘的毒害具有一定的作用。

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［責任編輯劉景平］

Dynam ic Analysis of Malondialdehyde Content inMorus AlbaSeed ling Leaves Under Cd2+Stress

QIN Yong－rong，FENG Ji－mei，LIANG W en－zhong，LIQiu－m ing，LIU Xu－hui
(Department of Chem istry and Life Science，Hechi University，Yizhou，Guangxi546300，China)

By water－implantation experiment，different concentrations of Cd2+are added to the nutrient solution respectively．In each solution of one group，treatmentwith 0.55 mmol/L EDTA is compared to the other groups untreated with EDTA．The dynamic changes ofmalondialdehyde(MDA)content in theMorusalbaleaves for 45 days are investigated．The results show that:(1)there are some relationship between MDA contents inMorusalbaleaves and Cd2+concentration in the solution．During the period of21 to 27days，MDA contentof the leaves has a rising trend of fluctuation at first，and then declines in a fluctuating state;(2)Compared with the groups untreated with EDTA，MDA content in the leaves not only remains at a relative stable level，but also increases gradually with time prolonging;(3)When Cd2+concentration is ata lower level，itwill promote the growth ofMorus albaseedling，butwhen Cd2+concentration is at a higher level，such poisonous effects will happen，that is，the growth of the seeding will be inhibited，and the leaves of seedingswill turn yellow or wither;(4)EDTA can alleviate Cd2+poisonous effects onMorusalbaseedlings．

Morusalbaseedling;heavymetal;Cd2+stress;malondialdehyde content

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X53

A

1672－9021(2012)02－0017－06

覃勇榮(1963－)，男，廣西平南人，河池學院化學與生命科學系教授，主要研究方向:高校生物學教學，巖溶地區生態修復。

廣西高校重點建設學科基金資助項目(桂教科研〔2007〕20號);廣西高校重點實驗室基金資助項目(桂教科研〔2010〕6號);廣西高等學校特色課程及專業一體化建設基金資助項目(桂教高教〔2011〕102號)。

2012－03－11