甘蔗糖蜜發酵產黃原膠優良菌株的選育

何海燕

(河池學院化學與生命科學系，廣西宜州546300)

甘蔗糖蜜發酵產黃原膠優良菌株的選育

何海燕

(河池學院化學與生命科學系，廣西宜州546300)

黃原膠是由野油菜黃單胞菌發酵生產的重要的商業微生物多糖產品，實驗通過微波誘變處理保藏菌株，篩選到一株能以甘蔗糖蜜為碳源發酵生產黃原膠的優良正突變株X12，實驗結果表明:在初步確定的實驗條件下，該菌株發酵生產黃原膠的產量達22.14 g/L，是未誘變菌株20183的1.53倍，傳代實驗表明，突變菌株X12的黃原膠產量及性狀無大變化，遺傳性狀穩定。

甘蔗糖蜜;黃原膠;微波誘變

黃原膠又稱為漢生膠，是一種用途廣泛的微生物胞外多糖。它無味、無臭、無毒、食用安全，是目前國際上集增稠、懸浮、乳化、穩定于一體，性能最優越的生物膠［1］，在石油工業、食品工業、醫藥、化工等諸多行業獲得了廣泛的應用［2］。目前，國內黃原膠發酵水平與國外先進水平相比尚有較大差距［3］，利用何種有效的途徑提高黃原膠的產量與多糖的品質，節約生產成本，成為近年來黃原膠研究的主要方向［4］。

甘蔗糖蜜是糖廠的主要副產品，成分非常復雜并且其含糖量仍非常高，蔗糖和還原糖占30%～50%，是發酵、食品、飼料和建材工業中質優價廉的原料［5］，中國是甘蔗種植大國，甘蔗糖蜜原料非常充足，用糖蜜原料發酵生產黃原膠，可降低成本，節約能源，具有一定的經濟及社會效益，實驗通過微波對黃原膠生產菌進行誘變育種，以期得到能利用甘蔗糖蜜高效發酵生產黃原膠的優良生產菌種。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)20183，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

1.1.2 儀器

YP202N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，SW－CL－2FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，GNP－9160BS－Ⅲ隔水式恒溫培養箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)，CS101－AB型電熱鼓風干燥箱(中華人民共和國重慶試驗設備制造)，K021B－BF美的微波爐(廣東美的微波爐制造有限公司)，TXQ－LS－SⅡ全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)，糖用錘度計(浙江余桃儀表二廠)。

1.1.3 培養基

糖蜜由廣西宜州石別糖廠提供，使用前按文獻［6］處理得糖蜜酸化水解液備用;其余試劑均為分析純試劑。

菌種活化培養基:蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH值為7.0。

菌種培養液:蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L，pH值為7.0。

平板培養基:蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，8°Bx糖蜜水解液1 L，pH值為7.0。

種子培養液:蛋白胨8 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.2 g，8°Bx糖蜜酸化水解液1 L，pH值為7.0。

搖瓶發酵培養基:蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸1 g，10°Bx糖蜜酸化水解液1 L，pH值為7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

將保藏菌種轉接至活化培養基中，28℃恒溫培養36 h，使菌種活化，用于下一步實驗。

1.2.2 微波誘變實驗

(1)活化菌株生長曲線的測定。

取斜面活化菌株一環至菌種培養液中，28℃、180 r/min搖床培養，從6 h后開始，每隔3 h取樣600 nm測其吸光度(A)值，以培養時間為橫坐標、吸光度(A)值為縱坐標繪菌株生長曲線，根據生長曲線選擇處于對數生長期的細胞進行誘變實驗。

(2)微波誘變致死率曲線。

取10 mL處于對數生長期的菌種接入裝有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，并用玻璃珠振蕩，打散菌落。使用十倍稀釋法稀釋菌懸液，用血細胞計數法計數，選取約108個孢子/mL孢子菌懸液，分裝5 mL至無菌離心管中，以900 W功率微波爐進行輻射處理，每次照射10 s后使平皿冷卻，消除熱效應，再進行照射，并將照射時間累計［7］。按照常規方法稀釋濃度梯度涂布篩選平板，根據菌落數計算致死率并繪畫致死曲線。

(3)黃原膠菌株誘變突變株篩選。

根據致死率曲線，以致死率為70%～80%的誘變劑量處理菌株［8］，經過輻射后涂布平板，在28℃下培養3 d，從平板上挑取大而圓的菌落接到搖瓶種子培養基內，置180 r/min搖床28℃恒溫培養36 h，然后以10%接種量，裝液量200 mL/500 mL三角瓶，28℃恒溫搖床180 r/min培養72 h進行搖瓶復篩。

(4)遺傳穩定性實驗。

將選育出的產膠量最高的菌株接種于活化培養基上傳代，共傳六代，相同條件下發酵培養，測黃原膠產膠量，檢測誘變所得黃原膠菌株的遺傳穩定性。

1.2.3 黃原膠提取方法［9］

將95%乙醇和發酵液按1∶2比例混合，室溫下攪拌20 min，過濾，得到黃原膠沉淀置于烘箱中，60℃烘干至恒重稱量。

2 結果與分析

2.1 實驗菌株生長曲線

菌種接種到均勻的液體培養基后，細菌以二分裂繁殖。經過遲緩期進入對數生長期，并以最大的速率生長和分裂，導致細菌數量呈對數增加，此時細菌生長呈平衡生長，即細胞內各成分按比例有規律地增加，所有細胞組分呈彼此相對穩定速度合成。對數生長期細菌的代謝活性高而穩定，細胞大小比較一致，生活力強，易變異，重復性較好。由圖1可知，該菌株對數生長曲線為9～21 h，24 h后進入穩定期，所以選擇培養18 h的菌液進行誘變處理。

圖1 菌株20183的生長曲線

2.2 微波誘變實驗

2.2.1 微波誘變致死率曲線

微波誘變是一種新興的物理誘變育種技術，且設備相對簡單，易于操作，安全高效。微波輻射會產生熱效應，引起生物迅速升溫并導致各種生物功能產生變化。隨著微波時間的延長，致死率逐漸增大。由圖2可知，當輻射時間為60 s時，致死率在70%～80%之間。根據誘變的機制，菌株的正突變幾率可能性最大，因此選用60 s作為誘變篩選的輻射時間。

圖2 微波誘變致死率曲線

2.2.2 黃原膠菌株誘變突變株篩選

以單位體積發酵液黃原膠的產量為篩選指標，篩選到1株黃原膠產量有較大提高的正突變株X12，由表1可知，該菌株黃原膠的產量達到了22.14 g/L，是未誘變菌株的1.53倍。

表1 微波誘變后菌株的黃原膠產量對比

2.2.3 遺傳穩定性實驗

為檢驗突變菌株X12發酵產膠的穩定性，實驗將突變菌株連續傳代6次，每代按初步確定的發酵條件測定其黃原膠產量。實驗結果見表2，實驗結果表明，突變菌株經過微波輻射誘變后，基因發生了突變，總產量得到提高且產量基本維持在22.14 g/L左右，有較好的遺傳穩定性。

表2 突變菌株X12傳代實驗結果

3 結論

甘蔗糖蜜來源廣，價格低，是重要的工業發酵原料，實驗通過微波誘變處理保藏野油菜黃單胞菌20183，篩選到一株能以甘蔗糖蜜作為發酵原料生產黃原膠的優良正突變株X12，該菌株的黃原膠產量達22.14 g/L，是未誘變菌株的1.53倍，傳代實驗表明，該菌株遺產性狀穩定。

［1］常春，馬曉建，方書起，等.黃原膠補料分批發酵工藝的試驗研究［J］.食品科學，2005，26(12):261－265.

［2］李衛旗，吳雪昌，姚恕.培養基的組成對黃原膠發酵產量與質量的影響研究［J］.工業微生物，1996，26(1):17－19.

［3］姚仕義，王金生.黃原膠生產菌株XCCNAU－92的選育［J］.生物技術，1998，(3):34－37.

［4］楊春玉，王霞，蘇海軍，等.黃原膠生物合成的研究進展［J］.現代化工，2005，25(2):24－28.

［5］保國裕.1998甘蔗糖綜合利用及廢液治理技術動態［J］.廣西蔗糖，1999，14(1):38－44.

［6］張克旭.氨基酸發酵工藝學［M］.北京:中國輕工業出版社，1992.

［7］周建琴，高榮梅.康樂霉素C產生菌的微波誘變［J］.生物學雜志，2002，19(14):12－13.

［8］劉冬，張學仁.發酵工程［M］.北京:高等教育出版社，2007.

［9］里景偉.黃原膠的生產與應用［M］.北京:輕工業出版社，1995.

［責任編輯劉景平］

The Selection of High Yield Xanthan Gum Producing Strain by Using Sugar－cane Molasses Fermentation

HE Hai－yan
(Departerment of Chem istry and Life Science，Hechi University，Yizhou，Guangxi546300，China)

Xanthan gum is a commercially important polysaccharide produced by fermentation of Xanthomonas campestris．In this study，preservation of strainswas treated by usingmicrowave irradiation，and then a high yield Xanthan gum producing bacterium X12 that can use sugar－canemolasses as fermentation carbon source was selected．The experimental results show that under the experimental condition of the initial establishment，and that the yield of Xanthan gum is 22．14 g/L，153%higher than the original strain 20183．

sugar－canemolasses;Xanthan gum;microwavemutation

book=0,ebook=67

Q939.97

A

1672－9021(2012)02－0022－04

何海燕(1972－)，女，廣西鐘山人，河池學院化學與生命科學系副教授，主要研究方向:微生物發酵研究。

2011－12－05