淀粉酶產生菌的分離篩選

盧福芝，錢豐，楊琴，勞斌

(河池學院化學與生命科學系，廣西宜州546300)

淀粉酶產生菌的分離篩選

盧福芝，錢豐，楊琴，勞斌

(河池學院化學與生命科學系，廣西宜州546300)

從大米廠、淀粉廠周邊環境土壤中篩選到三株產淀粉酶能力較強的菌株Jz1、Jz2、Jz3。經形態特征及染色等初步鑒定，菌株Jz1和Jz3為芽孢桿菌屬(Bacillus)，菌株Jz2為短小桿菌屬(Curtobacterium)。采用YoungJ.Y00改良法測定此三株菌株的淀粉酶活力分別為47.29 U/mL、48.48 U/mL、49.74 U/mL，具有較好的應用潛力。

淀粉酶;篩選;鑒定

淀粉酶(E3.2.1.1)是水解淀粉和糖原酶類的總稱，廣泛存在于動植物和微生物中，是最早實現工業生產，并且是迄今為止用途最廣、產量最大的酶制劑品種［1］。淀粉酶種類繁多，特點各異，廣泛應用于食品加工、醫藥、造紙、印染、釀造、洗滌劑、工業副產品及廢料的處理、飼料工業及微生態制劑等多種領域［2－3］。我國淀粉資源豐富，淀粉酶應用范圍非常廣泛，使用量巨大，但我國酶制劑產品的品種少，劑型少，產品結構極不合理，應用范圍非常狹窄，應用領域僅局限于淀粉加工和洗滌劑工業。而國際上其應用范圍卻遍及淀粉加工、洗滌劑、紡織、紙漿、造紙、酒精發酵、烘焙食品、動物飼料、果汁生產等眾多領域［4］。目前，工業上主要采用微生物發酵法大量生產淀粉酶制劑［5］。本文從土壤中篩選出產淀粉酶的菌株，并對菌株的形態特征進行鑒定及產酶能力的檢測，期望能將其應用于工業領域。

1 材料與方法

1.1 土壤來源

采自廣西宜州市慶遠鎮(原宜州市大米廠內)小型米粉加工作坊及廣西羅城科潮基業科技發展有限公司(羅城銀漢淀粉總廠)周邊的土壤。

1.2 培養基［6］

蛋白胨10 g/L，NaC l10 g/L，牛肉膏5 g/L，可溶性淀粉2 g/L。固體培養基加入瓊脂20 g/L，pH值7.0～7.2，0.1 MPa，滅菌20 min。

1.3 初篩方法

稱取土壤樣品1.0 g裝入小三角瓶中，加入9ml無菌水，充分振蕩后靜置，取上清液作濃度梯度稀釋［5］。吸取10－4、10－5、10－6稀釋液100μL均勻涂布于篩選平板上，于28℃培養箱中倒置培養120 h。待菌落長出后向培養平板均勻噴灑盧戈氏碘液，挑取有明顯透明圈的菌落轉接到液體培養基中，于28℃培養箱中培養36 h后，經劃線分離培養48 h獲得純種，再轉接到液體培養基中，28℃培養箱中培養24 h后于4℃保存［5］。

1.4 復篩方法

將所有初篩得到的菌種經活化培養后，取0.2μL菌液點樣到篩選平板上。28℃培養箱中倒置培養24 h，待菌落長出后向培養平板均勻噴灑盧戈氏碘液，測定水解透明圈及菌落的直徑，挑取d0/d1(d0為水解圈直徑，d1為菌落直徑)較大的菌株作為實驗菌株，進行菌種鑒定及酶活檢測。

1.5 細菌鑒定

根據《伯杰細菌鑒定手冊》(第8版)［7］，對所篩選到的菌株進行菌落特征、形態觀察及革蘭氏染色。

1.6 淀粉酶活力測定

采用YoungJ.Y00改良法［8－10］進行酶活力測定。其原理是根據淀粉酶將淀粉水解為長短不一的短鏈糊精和少量的還原糖而使淀粉對碘呈藍紫色特異反應逐漸消失的特性，通過顯色消失的速度來衡量酶活力大小。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離篩選

通過加入可溶性淀粉的固體培養基進行菌株的初步篩選，能在篩選平板上生長，噴灑盧戈氏碘液后產生透明圈的為篩選的目的菌株［5］。通過平板的初步篩選，在平板中共篩選出18株淀粉酶產生菌。將初篩得到的18株菌株進行復篩，培養后測定各菌株的水解透明圈直徑(d0)及菌落的直徑(d1)，并取d0與d1的比值作為衡量該菌株產淀粉酶的能力。據此從初篩的18株菌株中選出3株水解透明圈較大的菌株為實驗菌株，將其命名為Jz1、Jz2、Jz3，其d0/d1平均值分別為3.40、3.75、4.67。菌株Jz1、Jz2、Jz3的水解透明圈分別如圖1、圖2、圖3所示。

圖1 菌株Jz1的水解透明圈

圖2 菌株Jz2的水解透明圈

圖3 菌株Jz3的水解透明圈

2.2 菌株的鑒定［7］

對Jz1、Jz2、Jz3進行菌落形態、芽孢及鞭毛觀察及革蘭氏染色。其鑒定結果如表1所示。

表1 菌株鑒定結果

2.3 淀粉酶活力的檢測

將Jz1、Jz2、Jz3三株菌株接入液體培養基中進行發酵后，取發酵液于4℃，5 000 r/min，離心10 min，取上清液測酶活力。采用YoungJ.Y00改良法［8－10］進行酶活力測定，分別測定對照樣品及3株菌株在OD620nm的光密度值。按酶活力計算公式:

酶活力(U/mL)=(R0－R)/R0×50×D(式中R0、R分別為對照液、反應液的光密度;D為酶的稀釋倍數)。

根據公式計算得出3株菌株的酶活力分別為47.29 U/mL、48.48 U/mL、49.74 U/mL。其中酶活最高的為Jz3，其次是Jz2，最低是Jz1，這與d0/d1的測定結果相一致。

3 結論

(1)從原宜州市大米廠及羅城銀漢淀粉總廠周邊環境的土壤中，經多次分離篩選，獲得Jz1、Jz2、Jz3三株產淀粉酶能力較強的菌株，經測定其淀粉酶活力分別為47.29 U/mL、48.48 U/mL、49.74 U/mL。

(2)經形態特征及染色等初步鑒定，菌株Jz1和Jz3為芽孢桿菌屬(Bacillus)，菌株Jz2為短小桿菌屬(Curtobacterium)。

(3)實驗中篩選到的三株菌株具有較高的初始酶活力，可以通過優化菌株的培養基及產酶條件提高菌株的產酶能力，并對菌株的酶學性質進行深入的研究。由于此三株菌株都是從自然界獲得的野生菌株，后續實驗還可以通過誘變及分子改造等技術方法改良菌種，進一步提高其產酶能力。

［1］谷軍.淀粉酶的生產與應用［J］.生物技術，1994，4(3):1－5.

［2］張麗蘋，徐巖，金建中.酸性α－淀粉酶的研究與應用［J］.釀酒科技，2002，29(3):4－15.

［3］張樹政.酶制劑工業［M］.北京:科學出版社，1998.

［4］居乃琥.酶工程研究和酶工程產業的新進展(Ⅱ)——國內外酶制劑工業的現狀、發展趨勢和對策建議［J］.食品與發酵工業，2000，26 (4):38－43.

［5］張雙民.土壤中淀粉酶高產菌株的分離及產酶條件的優化［J］.土壤肥料，2006，(2):59－61.

［6］張強，劉成君，蔣芳，等.耐高溫α－淀粉酶產生菌的分離鑒定及發酵條件與酶性質研究［J］.食品與發酵工業，2005，31(2):34－37.

［7］BUCHANAN RE，GIBBONSNE.伯杰細菌鑒定手冊(第8版)［M］.北京:科學出版社，1984.

［8］朱何東，陳遠釗，常峰，等.高溫淀粉酶產生菌的篩選及酶學性質研究［J］.釀酒科技，2006，(5):30－32.

［9］天津輕工業學院，大連輕工業學院，無錫輕工業學院，等.工業發酵分析［M］.北京:輕工業出版社，1980.

［10］徐穎.高產α－淀粉酶產生菌的篩選鑒定及其酶學性質研究［D］.四川:四川大學，2007.

［責任編輯劉景平］

The isolation of am ylase－producing bacterial strains

LU Fu－zhi，QIAN Feng，YANG Qin，LAO Bin
(Departerment of Chem istry and Life Science，Hechi University，Yizhou，Guangxi546300，China)

Three bacterial strains Jz1、Jz2、Jz3 show high amylase activity，which were achieved from the soil near the rice and starch factories．The bacteria strains Jz1 and Jz3 are Bacillus after preliminary identification，while the bacterial strain Jz2 is Curtobacterium．The amylase activities of the three bacterial strains are 47.29 U/mL，48．48 U/mL and 49．74 U/mL respectively，determined by YoungJ．Y00modifiedmethod．They will be well applied in the future．

amylase;screening;identification

book=0,ebook=75

Q939.97

A

1672－9021(2012)02－0026－03

盧福芝(1984－)，女，廣西北流人，河池學院化學與生命科學系助教，主要研究方向:微生物及分子生物學。

河池學院青年科研基金資助課題(2011A－N004)。

2012－03－01