兩種髓鞘染色方法在Cuprizone誘導脫髓鞘小鼠模型中的比較

張 麗 尹琳琳 李 林

(首都醫科大學宣武醫院藥物研究室神經變性病教育部重點實驗室，北京100053)

多發性硬化是一種慢性中樞神經系統脫髓鞘疾病，其病理表現為神經纖維出現髓鞘變性、脫失和軸突變性等［1］。髓鞘是包裹在有髓神經纖維軸突外的脂質細胞膜，呈管狀結構，為階段性，其主要成分為類脂質和蛋白質［2］。雙環己酮草酰二腙(Cuprizone，CPZ)是一種選擇性銅離子螯合劑，小劑量能夠誘導中樞神經系統髓鞘脫失［3］，形成髓鞘細胞的少突膠質細胞死亡［4］，常作為誘導因子建立脫髓鞘動物模型。髓鞘染色在病理診斷和研究中具有重要意義。本研究應用Cuprizone誘導脫髓鞘小鼠模型，取腦后切片，分別以牢固藍(Luxol Fast Blue，LFB)和油紅O兩種染色方法觀察腦組織紋狀體和海馬2個斷面胼胝體髓鞘脫失狀況，比較染色方法的優劣，為研究者提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型建立

6周齡C57BL/6系小鼠，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔合格證號:SCXK(京)2006-0009〕，飼養于SPF級實驗室，自由進食飲水。小鼠采用抽簽法隨機分為對照組和模型組(n=3):對照組動物采用正常飼料飼育;模型組用含0.2%Cuprizone粉末的飼料飼育4周。

1.2 藥品與試劑

Cuprizone、油紅O、牢固藍購自Sigma公司。10%水合氯醛、0.9%氯化鈉注射液等由首都醫科大學宣武醫院制劑室提供。氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、多聚甲醛、蔗糖等購自北京化學試劑公司。

1.3 主要儀器

冰凍切片機(Thermo公司，美國);生物顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.4 取材

動物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取腦組織放入含有30%蔗糖和4%多聚甲醛固定液中，沉降后再換一次固定液即可。

1.5 牢固藍(LFB)髓鞘染色法［5］

取腦組織，行連續冠狀面冰凍切片，片厚20 mm，各組取相同平面。將腦片置于0.1%LFB/95%乙醇溶液中避光浸染過夜;95%乙醇漂洗3次，去除表面多余染料;0.05%碳酸鋰水溶液內分化;充分水洗;蘇木素染色1 min，鹽酸乙醇適度分色，自來水返藍，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，封片。

1.6 油紅O髓鞘染色法［6］

取0.5%油紅O/異丙醇儲存液與蒸餾水按3∶2比例混勻，靜置10 min后過濾。將組織切片置于預先配制好的油紅O染液中10～15 min，60%乙醇分色，在Harris蘇木精染液中淡染30 s，鹽酸、乙醇適度分色，每步之間用水沖洗，鏡檢。撈片后室溫中放置稍干，甘油明膠封片。

2 結果

2.1 小鼠腦組織紋狀體切面牢固藍(LFB)與油紅O髓鞘染色結果

油紅O染色將正常對照組小鼠腦組織紋狀體斷面胼胝體染成紅色，與皮質和紋狀體分界清晰(圖1A1)，Cuprizone模型組因髓鞘脫失，大量炎性細胞浸潤染成藍紫色(圖1B1)。牢固藍染色將正常對照組腦組織紋狀體斷面胼胝體染成亮藍色(圖1A2)，模型組殘存髓鞘染成藍色，炎性細胞為藍紫色，但與周圍組織分界不明顯(圖1B2)。

圖1 小鼠腦組織紋狀體斷面牢固藍與油紅O髓鞘染色Fig.1 Striatum section Luxol Fast Blue and oil red O staining in mouse(100×)

2.2 小鼠腦組織海馬切面牢固藍(LFB)與油紅O髓鞘染色

在小鼠腦組織海馬切面，牢固藍(LFB)與油紅O 2種髓鞘染色均可以清晰顯示胼胝體膝部和扣帶病理改變。正常對照組胼胝體分別呈紅色(油紅O染色，圖2A1)和亮藍色(牢固藍染色，圖2A2);Cuprizone模型組胼胝體髓鞘脫失嚴重，殘存髓鞘分別染成淡紅色(油紅O染色，圖2B1)和淡藍色(牢固藍染色，圖2B2)，以膝部尤為明顯(箭頭所示)。

圖2 小鼠腦組織海馬斷面牢固藍與油紅O髓鞘染色Fig.2 Brain hippocampus section Luxol Fast Blue and oil red O staining in mouse(100×)

3 討論

脫髓鞘疾病是以神經髓鞘脫失為主要或始發病變的神經系統疾病，可發生于中樞神經系統或周圍神經系統，如多發性硬化、彌漫性硬化、急性播散性腦脊髓炎等。此類疾病主要累及腦深部白質、腦室等部位，磁共振(MRI)掃描信號異常［7］。Cuprizone動物模型的病理表現為白質髓鞘含量下降、軸索消失、少突膠質細胞變性、炎性細胞浸潤等［8］;電鏡觀察發現白質內髓鞘結構分離和斷裂、線粒體腫脹變性等超微結構改變［9］。

牢固藍(LFB)染色是脂溶性染料浸染法的一種，也是檢測中樞神經系統白質變化的常用方法。Luxol是國際上認可的髓鞘染色劑，主要依據其在乙醇溶液內可與髓鞘磷脂結合染色的特點，利用組織灰白質在乙醇和碳酸鋰中對牢固藍結合力度不同，將灰質染成淡藍色，白質染成亮藍色，借助色差區分灰質與白質的界限。LFB方法常復染蘇木素以顯示組織結構，細胞核染成藍紫色［10］。本實驗中，在海馬冠狀面切片染色中，正常對照組胼胝體的髓鞘呈亮藍色，與皮質、海馬分界清晰，髓鞘及組織結構易于觀察;在紋狀體斷面，正常對照組層次清晰。但是，Cuprizone模型組因髓鞘大量丟失，炎性細胞浸潤，經蘇木素復染后，胼胝體部位藍紫色細胞核與牢固藍的亮藍色界限不明顯。油紅O屬于偶氮染料，是很強的脂溶劑和染脂劑。脂溶性染料能溶于組織和細胞中的脂類，它在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當組織切片置入染液時，染料則離開染液而溶于組織內的脂質(如脂滴)中，使組織內的脂滴呈橘紅色。本實驗中，無論是海馬切面還是紋狀體切面，經油紅O染色后均可將胼胝體與周圍結構清晰區分，紅色亮麗，與組織背景對比明顯。

在Cuprizone誘導的脫髓鞘小鼠模型中，通過牢固藍(LFB)與油紅O兩種髓鞘染色方法比較發現，兩種方法均可特異性地將海馬切面的胼胝體部位清晰區分，界限明顯，對神經髓鞘具有良好的標記作用;但在紋狀體切面油紅O法能更明顯區分周圍組織結構。切片經牢固藍染色后可通過二甲苯透明、中性樹膠封片的步驟，適于長期保存，但有些部位染色界限不夠明顯;而油紅O染色可避免此問題。配制油紅O染液的異丙醇易揮發，對人體健康有害，染液產生沉淀，用前需過濾，每次染色時新鮮配制［11］;組織染色后需待略干后用甘油明膠封片，應小心操作，避免組織結構被破壞或有皺褶，影響鏡下觀察。

總之，牢固藍(LFB)與油紅O兩種髓鞘染色方法具有操作簡單、特異性好、易于掌握等特點，是神經系統脫髓鞘等疾病可靠的實驗方法，臨床及實驗室可根據實際工作需要選擇。

［1］朱穎，劉鶴南，張朝東.血清維生素B12水平與多發性硬化關系的Meta分析［J］.中國醫科大學學報，2010，39(3):234-237.

［2］賈建平.神經病學［M］.北京:人民衛生出版社，2010:258.

［3］王洪凱，梅峰，劉志，等.不同年齡小鼠脫髓鞘動物模型中腦內星形膠質細胞激活情況的觀察［J］.第三軍醫大學學報，2012，34(8):696-700.

［4］Kipp M，Clarner T，Dang J，et al.The cuprizone animal model:new insights into an old story［J］.Acta Neuropathol，2009，118(6):723-736.

［5］Sribnick E A，Wingrave J M，Matzelle D D.Estrogen attenuated markers of inflammation and decreased lesion volume in acute spinal cord injury in rats［J］.J Neurosci Res，2005，82(2):283-293.

［6］Steelman A J，Thompson J P，Li J.Demyelination and remyelination in anatomically distinct regions of the corpus callosum following cuprizone intoxication［J］.Neurosci Res，2012，72(1):32-42.

［7］陳吉波.成人腦白質病的CT及MRI診斷［J］.現代醫藥衛生，2008，24(10):1462-1464.

［8］尹琳琳，林麗莉，王蕾，等.實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠模型的建立及病理特征［J］.首都醫科大學學報，2011，32(1):84-89.

［9］劉煜，李柱一，林宏，等.實驗性自身免疫性腦脊髓炎神經元、膠質細胞及其細胞縫隙連接的超微結構改變［J］.中國神經免疫學和神經病學雜志，2009，16(1):3-7.

［10］呂廣明，吳輝群，栗卓，等.大鼠皮質脊髓束 Luxol Fast Blue染色［J］.南通大學學報:醫學版，2008，28(1):5-7.

［11］田玉旺，李琳，李麗，等.介紹一種改良的油紅O脂肪染色法［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2007，16(6):736.