長期遠隔后適應對腦缺血再灌注大鼠腦組織神經中絲200表達的影響

閆 峰 劉向榮 趙海蘋 王榮亮 吉訓明 羅 玫 羅玉敏

(首都醫科大學宣武醫院腦血管病研究室北京市老年病醫療研究中心，北京100053)

缺血性腦血管病在腦血管病中占絕大多數，對于缺血性腦血管病的保護研究已經成為熱點。近來有研究［1-2］報道，基于保護缺血心肌免受再灌注損傷的預適應所產生的遠隔后適應可以通過一定方式有效保護卒中腦組織，這種保護是在中風即刻或再灌注即刻給予一次后適應。本實驗是在此基礎上，觀察遠隔后適應的長期應用是否與神經中絲(NF)表達有關。NF是神經元特有的結構蛋白，是構成神經元胞體和軸突細胞骨架及維持細胞形態重要的結構蛋白，可反映神經元功能及軸突再生情況。有研究［3］表明，NF200在脊髓損傷中起到修復神經元的作用，但其對缺血性腦損傷的影響鮮有報道。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性SD大鼠24只，體質量280～300 g，購自北京維通利華實驗動物公司〔動物許可證號:SCXK(京)2012-0001〕。飼養于SPF級動物室，自由進食進水。大鼠采用抽簽法隨機分為4組:①缺血再灌注7 d組(C7，n=6);② 缺血再灌注后適應7 d組(P7，n=6);③ 缺血再灌注 28 d 組(C28，n=6);④缺血再灌注后適應28 d組(P28，n=6)。

1.2 儀器

小動物呼吸機(Harvard Apparatus 683)、雙極電凝(德威，DEVEL，ACC100)、顯微鏡(Carl Zeiss)、反饋式溫度調節儀(Harvard Apparatus)、血氣分析儀(美國，ABBOTT，i-STAT)、多導生理記錄儀 (biopac mp100)、激光多普勒血流儀(PERIMED，PeriFlux System 5000)，顯微手術器械。

1.3 動物模型制作

采用改良的Zea Longa法［4］制備大鼠腦缺血再灌注(MCAO)模型。大鼠稱體質量后5%恩氟烷混合70%N2O、30%O2誘導麻醉，2%恩氟烷混合70%N2O、30%O2維持麻醉。頸部正中切口，分離右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，使用頭端直徑為0.38 mm的尼龍線栓由頸外動脈殘端插入頸內動脈，至距頸內動脈和頸外動脈分叉處約2 cm，缺血時間為2 h。使用反饋式控溫毯監測大鼠肛溫，將大鼠體溫保持于36.5℃ ～37.5℃。分離大鼠尾動脈插入PE-50管持續監測血壓，每半小時測一次血氣(pH，PO2，PCO2)。術中使用激光多普勒監測腦血流以確保模型的成功。

1.4 遠隔缺血后適應方法

動物吸入麻醉后使用橡皮止血帶阻斷動物雙下肢血流，分別于再灌注即刻及實驗周期中每天進行1次，每次阻斷10 min，開放10 min，循環3次。對照組每次麻醉但不阻斷血流。

1.5 Western blotting

每組留取3只大鼠，在缺血再灌注第7天和第28天處死大鼠，留取缺血側皮質腦組織。提取皮質腦組織蛋白、測定蛋白濃度:腦組織于冰上加入裂解液，用超聲波細胞粉碎機進行勻漿，冰浴30 min，使用4℃離心機12 000 r/min，離心30 min，取上清。根據BCA法參照標準蛋白濃度，于560 nm處測定樣本的吸光度值(A值)。根據標準蛋白曲線計算各樣本的蛋白含量。配制8%分離膠和5%積層膠，取60 μg蛋白樣品溶于相應體積的上樣液中，水浴鍋95℃ ～100℃加熱5 min蛋白變性后即刻加樣。室溫下80 V電泳1 h，蛋白樣品到達分離膠后將電壓調為100 V，繼續電泳約1.5 h。配制電轉液，4℃下以90 V 120 min的條件下轉至預先用甲醇處理好的NC膜上。將膜置于TBST中清洗3次，每次10 min，置入5%脫脂牛奶中封閉2 h。置入一抗中4℃孵育過夜，次日去掉一抗，TBST清洗3次，每次10 min，再置入二抗中室溫孵育1 h。抗體做如下稀釋:NF200抗體(1∶1 000，Abcam公司)、β-actin抗體(1∶2 000)、HRP標記山羊抗兔抗體(1∶2 000)。化學發光法檢測條帶。AlphaE-aseFC軟件分析蛋白條帶的相對吸光度。

1.6 免疫熒光染色

每組留取3只大鼠，分別在缺血再灌注第7天和第28天處死大鼠，在大鼠腦模具中以視交叉開始冠狀位向前及后各留取2 mm厚的腦組織，石蠟包埋，切片，進行免疫熒光染色。步驟如下:腦組織切片依次進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇入水，H2O2/甲醇溶液消除內源性過氧化物酶活性，EDTA抗原微波熱修復12 min，小牛血清封閉非特異性抗原1 h;滴加NF200抗體(1∶1 000，Abcam公司);加TRITC山羊抗兔IgG，室溫孵育30 min;PBS漂洗3次，每次3 min;DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0進行統計分析，所有資料用均數±標準差(±s)表示，各數據組間比較使用單因素方差分析法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 遠隔缺血后適應對大鼠腦缺血NF200含量的影響

如圖1所示，P7組大鼠腦組織內NF200表達比C7組顯著增高(P＜0.05);P28組大鼠腦組織內NF200表達比C28組及P7組顯著增高(P均＜0.05);C28組大鼠與C7組大鼠比較，腦組織內NF200表達差異無統計學意義(P＞0.05)。圖2為長期遠隔缺血后適應對大鼠腦缺血后腦組織NF200含量影響的定量分析結果。

2.2 大鼠腦缺血NF200蛋白表達免疫熒光結果

為進一步探討NF200蛋白表達的部位，我們應用免疫熒光染色對NF200/DAPI(代表神經元細胞核)進行了染色，發現缺血損傷后NF200在神經元及軸突中均有表達，實驗組的陽性染色神經元及軸突較對照組明顯增加，28天后適應組的陽性染色神經元及軸突較7天后適應組的亦明顯增加，箭頭所指為陽性染色的神經元(圖3)。

3 討論

NF是神經元特有的結構蛋白，特異性的分布于神經元的胞體及突起內，在胞體內多交叉成網。NF根據相對分子質量的不同可分為 NF68、NF160和NF200 3種，其中NF200在正常情況下只存在于軸索中，而胞體不含或很少含有，故正常情況下神經元胞體NF200染色為陰性。腦組織受到損傷時，損傷區域鄰近的神經元在創傷刺激及多種誘導因子的作用下，開始大量合成及積存NF200，以適應軸突再生的需要，NF200積存于胞體內而使胞體著色，因此NF200是指示軸突再生狀況的一個間接指標［5-7］。

NF200在脊髓損傷中的研究較缺血腦損傷中更為深入，有文獻［8］報道，脊髓損傷后由于很多成熟的神經元在軸突損傷后并沒有死亡，而再生過程中軸突并無合成蛋白的能力，恢復中的神經元胞體不斷合成新的蛋白質及其他產物輸向軸突，這些結構是神經再生的基礎，在維護神經元的功能和軸漿的轉運等方面發揮著重要作用。有研究［9］表明，脊髓損傷后NF200的陽性表達程度與神經功能恢復有著密切的聯系。

以往認為神經細胞一旦受到損傷則無再生能力，但目前研究［10-11］認為未成熟腦細胞的可塑性較強，如Kim等［10］發現只要給予受損神經細胞以適當的神經生長因子環境，受損的神經細胞可以再生。之前有研究［12］報道遠隔后適應可以增加神經生長因子等一些相關蛋白表達，起到減少缺血造成腦損傷程度的作用。NF200作為神經中間絲，是缺血損傷后神經軸突出芽和再生的重要標志，其表達對細胞骨骼蛋白在細胞正常形態、細胞分化和轉化等方面具有至關重要的作用［13］。

根據NF200在脊髓損傷前后變化的特性，本實驗觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后NF200的變化情況，并且觀察了大腦中動脈缺血后長時間給予多次肢體遠端后適應腦皮質神經元內NF200的變化，發現了與脊髓損傷中相似的情況，即陽染的神經元在損傷區周邊神經細胞胞體及軸突內均有分布。根據NF200在神經細胞胞體及軸突中作為細胞骨架的重要成分，我們可以推測腦缺血再灌注損傷后神經元具有自發的軸突再生的潛力，而遠隔缺血后適應7天組相對于單純缺血7天組，遠隔后適應28天組相對于單純缺血28天組NF200表達均有明顯的增加，說明長時間多次的遠隔缺血后適應有利于損傷的神經纖維再生，而且后適應28天組相對于后適應7天組NF200的表達又有明顯的增加，更說明了長期給予遠隔缺血后適應可持續的促進神經纖維再生，對神經功能的恢復有更加積極的作用。

圖3 免疫熒光染色檢測腦缺血大鼠腦組織NF200蛋白的表達及長期遠隔后適應的作用Fig.3 Immunofluorescence staining of NF200 in the brain of rats following cerebral ischemia and the effect of remote ischemic post-conditioning in long term(200×)

研究遠隔缺血后適應的機制可以幫助我們更好的找到腦缺血時機體的內源性保護機制。本實驗提示我們長期多次的給予遠隔缺血后適應確實可以對機體產生積極的作用。

［1］Geng X，Ren C，Wang T，et al.Effect of remote ischemic post-conditioning on an intracerebral hemorrhage stroke model in rats［J］.Neurol Res，2012，34(2):143-148.

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［5］Lever I J，Robinson M，Cibelli M，et al.Localization of the endocannabinoid degrading enzyme fatty acid amide hydrolase in rat dorsal root ganglion cells and its regulation after peripheral nerve injury［J］.J Neurosci，2009，29(12):3766-3780.

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［12］張營，劉向榮，吉訓明，等.腦缺血-再灌注損傷對大鼠腦組織髓磷脂相關糖蛋白表達的影響［J］.中國腦血管病雜志，2010，7(11):588-591.

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