葉酸和維生素B12對人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞的保護作用

張景燕 陳 娟 王 蓉 趙靜姝 吳燕川

(首都醫科大學宣武醫院中心實驗室神經變性病教育部重點實驗室北京老年病醫療研究中心，北京100053)

老年性癡呆(Alzheimer disease，AD)是一種以進行性認知功能損害和記憶力減退為主要特征的中樞神經系統退行性疾病。隨著人口老齡化不斷加劇，AD的發病率和患病率逐年增加，研究如何防治AD、降低發病率勢在必行［1］。Piazza等［2］認為機體內同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)增高可致神經細胞毒性，是誘發AD的因素之一，而Hcy是含硫的氨基酸，需要通過人體必需氨基酸甲硫氨酸(Hcy的唯一前體)代謝脫去甲基后形成。體內Hcy濃度受到各種因素的影響，最常見的如飲食中葉酸和維生素B12缺乏，即可引起Hcy濃度增高，從而導致AD的發生［3］。本實驗擬通過觀察葉酸和維生素B12對人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞的影響，探討葉酸和維生素B12對神經細胞的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1)細胞株:人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞來自瑞典卡羅琳斯卡醫學院。

2)試劑:葉酸和維生素B12系SIGMA-ALDRICH公司產品。MTT〔噻唑藍，3-(4，5-dimethylthyl thiazo-l 2-yl)-2，5diphenyltetrazolium broide〕系 Sigma公司產品。二甲基亞砜(DMSO)系北京亞太精細化工公司產品。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑系北京森美希康試劑公司產品。

1.2 方法

1)細胞培養:用含10%胎牛血清的MEM培養基，于37℃，5%CO2培養箱中培養，6 d傳代1次，中間換液1次。

2)MTT代謝率測定:將生長良好、傳代穩定的SH-SY5Y細胞以1×104/mL的密度接種于96孔板(Nunc產品)，每孔體積200 μL，48 h后分為4組進行實驗。包括:對照組、葉酸組、維生素B12組、葉酸+維生素B12組，各組細胞數及培養液體積均相等，于接種后第3天，每孔加MTT(5 g/L)20 μL，37℃孵育4 h，吸出培養液，每孔加入 DMSO 200 μL，振搖 10 min，用全波長酶標儀(multiskan spectrum)測定550 nm處吸光度值(A)。

3)LDH漏出率測定:將SY5Y細胞以1×104/mL的密度接種于48孔板，每孔體積500 μL，48 h后分組(同MTT代謝率測定)。于接種后第3天留取各組細胞培養液，用日立7170生化分析儀進行酶法測定。

4)細胞計數:將細胞密度調整為1×104/mL的密度接種于48孔板，每孔體積500 μL，48 h后分組(同MTT代謝率測定)。于接種后3 d對各組細胞進行計數。

5)培養細胞形態觀察:倒置顯微鏡下觀察培養的細胞，比較實驗組和對照組細胞的形態。

1.3 統計學方法

應用SPSS 11.5統計軟件，計量數據用均數±標準差(±s)表示，進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT代謝率測定

MTT檢測結果顯示，葉酸組、維生素B12組、葉酸+維生素B12組可使SH-SY5Y細胞MTT代謝率升高，線粒體活性增強，與對照組相比，P＜0.05，差異有統計學意義(表1)。

表1 葉酸、維生素B12、葉酸+維生素B12對SH-SY5Y細胞MTT代謝率的影響Tab.1 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the metabolic rate in SH-SY5Y

2.2 LDH漏出率測定

用酶法測定的LDH漏出率結果顯示，與對照組相比，葉酸組、維生素B12組、葉酸+維生素B12組SH-SY5Y細胞LDH漏出率降低，說明細胞死亡率降低，差異有統計學意義(P＜0.05)(表2)。

表2 葉酸、維生素B12、葉酸+維生素B12對SH-SY5Y細胞LDH漏出率的影響Tab.2 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the LDH leakage rate in SH-SY5Y

2.3 細胞計數

細胞計數結果顯示，SH-SY5Y細胞中分別加入葉酸、維生素B12以及葉酸和維生素B12共同作用后，細胞計數明顯高于對照組，進行數據比較后差異具有統計學意義(P＜0.05)(表3)。

表3 葉酸、維生素B12、葉酸+維生素B12對SH-SY5Y細胞計數的影響Tab.3 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the cell count in SH-SY5Y

3 討論

葉酸又稱蝶酰谷氨酸，是B族維生素，由喋啶核、對氨苯甲酸及谷氨酸三部分組成，人體不能自行合成，葉酸在體內可轉變成葉酸的活性型四氫葉酸。維生素B12也屬B族維生素，在葉酸的代謝中必不可少，并且都是同型半胱氨酸(Hcy)合成蛋氨酸的輔酶。葉酸能夠促進神經系統的正常發育，在調控神經生成和程序性細胞死亡中起重要作用。

由于機體內Hcy濃度與葉酸和維生素B12的水平呈負相關［4-5］，當葉酸和維生素B12在體內的水平降低時，Hcy濃度增高，對神經細胞產生毒性作用，導致細胞凋亡和DNA損傷，從而增加老年性癡呆患病的風險。老年人的日常飲食攝入量較少，可能造成各種營養包括葉酸和維生素B12的缺乏［6-7］，從而影響Hcy的代謝轉化，如果能夠及時的補充營養，尤其是B族維生素(葉酸和維生素B12)可以加強Hcy的代謝，降低血Hcy的含量［8-13］，減緩老年人認知功能的減退，對預防AD起到積極防治作用，同時，補充葉酸、維生素B12簡單易行，能夠讓老年群體接收。本實驗證明，葉酸、維生素B12對于神經細胞確實存在保護作用，尤其是二者合用效果更為明顯，能夠增加細胞的生長代謝，減少細胞死亡，此結果為通過補充葉酸、維生素B12保護神經元、預防AD提供了基礎實驗依據。

總之，本研究通過觀察葉酸、維生素B12對人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞的作用，從細胞水平上研究了葉酸、維生素B12對神經細胞的保護作用，對于臨床上防治AD具有參考意義。

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