特異性小干擾RNA抑制誘騙受體3在結腸癌SW480細胞表達的研究

何 平 伍冀湘* 鐘晨熙 戴 潔 梁杰雄 李 洋 許英晨 于 瑋

(1.首都醫科大學附屬北京安貞醫院普外科，北京100029;2.首都醫科大學基礎醫學院病理學系，北京100069)

誘騙受體3(decoy receptor 3，DcR3)/又稱腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)6B/TR6是1998年Pitti等［1］發現的一種可溶性TNFR超家族的新成員。它可競爭性地與腫瘤壞死因子超家族成員人凋亡相關因子配體(people apoptosis related related factor ligand，FasL)、皰疹病毒侵入介體配體(herpes virus intrusion fixator lagand，LIGHT)及腫瘤壞死因子樣配體(tumor necrosis factor sample ligand，TLIA)結合，在腫瘤免疫、移植免疫、自身免疫及抗感染免疫中都發揮著重要的作用［2］。構建人特異性DcR3小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)表達質粒，轉染入人結腸癌SW480細胞系，檢測內源性DcR3基因的表達情況，為進一步研究DcR3在體內惡性腫瘤的發生、發展以及腫瘤的免疫逃逸等相關作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系

人結直腸癌細胞株SW480(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。

1.1.2 主要試劑

1)細胞培養:RPMI 1640細胞培養液(美國GIB-CO公司)，胎牛血清(天津川頁生化制品公司)。

2)siRNA表達質粒構建、提取及轉染:pSUPER質粒(中日友好醫院腎病中心饋贈)，DcR3的siRNA特異引物合成(上海生工生物工程公司，詳見表1);T4聯接酶、限制性內切酶(日本寶生物公司)，質粒中提試劑盒(美國Promega公司)，Lipofectamine 2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)。

3)RNA提取、反轉錄及多聚酶鏈反應試劑:總RNA提取試劑盒(上海生工生物工程公司)，莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)反轉錄酶(美國Promega公司)，Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑(華美生物工程公司)，PCR引物(上海生工生物工程公司，詳見表2)。

4)蛋白免疫印跡:小鼠抗人DcR3單克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG(美國Santa Cruz公司);ECL發光試劑盒(美國 Roche公司)。

表1 DcR3的siRNA特異引物合成Tab.1 DcR3 siRNA specific primer synthesis

表2 PCR引物序列Tab.2 Primer sequences

1.2 方法

1)siRNA序列篩選:自GeneBank中查找人DcR3全序列，編號AF104419。通過Dharmacon公司的網上siRNA設計工具siDESIGNR○Center，設計siRNA序列;根據結果，選擇最佳序列進行合成。

2)DcR3的pSUPER表達質粒的構建:用限制性內切酶(BgⅢ/HindⅢ)將pSUPER載體進行酶切處理;將配對的2條引物加入延伸緩沖液形成雙鏈，經磷酸化后處理后與經載體聯接。聯接后的載體經轉化和擴增后，提取質粒進行鑒定。鑒定成功后進行中提，以用于轉染。

3)SW480細胞培養:將SW480用含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養液在37℃、5%CO2條件下孵育2～3 d后，傳代1次，計數后按1×105個細胞/孔接種于100 mm培養皿中，2 d后細胞達到80%融合，融合后的細胞用于實驗。

4)質粒轉染:將 6 μg純化的質粒以 Lipofectamine 2000為介質轉染入SW480。

5)反轉錄及PCR測定:提取總RNA并反轉錄。以反轉錄所獲cDNA為模板，以β-actin為內參照，檢測DcR3的表達。經PCR擴增后行凝膠成像后，用Scion Image 4.03進行分析，結果以所測樣品指標的吸光度值與作為內參照的β-actin吸光度比值來表示。

6)蛋白免疫印記:SW480轉染48 h后，分別加入十二烷基硫酸鈉樣本緩沖液裂解細胞(內含100 mmol/L Tris-HCl、2%SDS、5% β 巰基乙醇及10%甘油)，冰上裂解10 min，刮下細胞及其裂解產物，超聲波粉碎后煮沸5 min，離心，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V恒壓轉膜，分別用小鼠抗人DcR3單克隆抗體(第一抗體)及HRP標記的羊抗小鼠IgG(第二抗體)進行雜交，ECL試劑盒發光，暗室曝光X片，凝膠掃描分析系統(Scion Image 4.03軟件)測定吸光度。

7)MTT法檢測DcR3-siRNA對SW480細胞生長的影響:取對數生長期細胞接種于96孔培養板中，每孔加100 μL，每組6孔，接種24 h后棄去上清，分別加入 pSUPER-hDcR3-1、pSUPER-hDcR3-2和 pSUPER-Con(終濃度0.1 nmol/L)，置于37℃、5%CO2培養箱中無血清繼續培養6 h，再各補加無雙抗含10%小牛血清的RPMI-1640 100 μL。于48 h后加入MTT 20 μL，繼續培養4 h后離心棄上清，加入DMSO 150 μL，震蕩15 min后，酶標儀下讀取吸光度(A)。

細胞存活率=(實驗組吸光度/空白對照組吸光度)×100%。

1.3 統計學方法

采用SPSS 12.0進行統計學處理。計量資料數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較行單因素方差分析和均數多重比較。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 DcR3特異性siRNA篩選與構建

本研究使用的pSUPER載體含H1Ⅲ型聚合酶啟動子，能精確高效地轉錄出發夾狀RNA，進而在體內被切割成可以發揮RNAi效應的siRNA［3］。

根據 GeneBank中的人 DcR3全序列(AF104419)，利用siDESIGNR○Center，(http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx)，設計 siRNA。其中 GGAACTACCTGGAGCGCTG(345～364)和ACGCGGAGTGGCAGAAACA(181～200)兩段序列的積分最高，被選為本實驗中的siRNA的靶序列，命名為 siRNA-1、siRNA-2。按pSUPER載體要求合成引物并聯接入載體后，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定和DNA序列分析，序列與預期完全相符，證明克隆構建正確。將鑒定正確的重組質粒命名為pSUPER-hDcR3-1和pSUPER-h DcR3-2，無關序列重組質粒為pSUPER-Con(為pSUPER-hDcR3-1的錯配序列)(圖1)。

圖1 EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定重組質粒DcR3 siRNA表達質粒Fig.1 EcoRⅠand HindⅢdouble enzyme identification of recombinant plasmid DcR3 siRNA expression plasmid

2.2 Dcr3 siRNA對SW480中DcR3 mRNA表達的抑制作用

將重組質粒pSUPER-hDcR3-1、pSUPER-hDcR3-2和pSUPER-Con瞬時轉染入SW480細胞，36 h后提取細胞總RNA進行反轉錄，以β-actin作為內參照，檢測DcR3的mRNA的表達變化，實驗獨立重復3次，每組樣本例數為6。結果顯示轉染pSUPER-hDcR3-1后，細胞DcR3 mRNA表達顯著下降(P＜0.01);轉染pSUPER-hDcR3-2后，細胞DcR3 mRNA表達也有顯著下降(P＜0.01)，說明針對DcR3的siRNA在真核細胞中表達后可以抑制DcR3的mRNA表達(圖2，表3)。

表3 siRNA對SW480中DcR3 mRNA表達的抑制作用Tab.3 siRNA inhibition of DcR3 mRNA expression in SW480(±s，n=6)

表3 siRNA對SW480中DcR3 mRNA表達的抑制作用Tab.3 siRNA inhibition of DcR3 mRNA expression in SW480(±s，n=6)

* P＜0.01 vs pSUPER-Con group;DcR3:decoy receptor 3.

Group β-actin DcR3 Relative expression quantity pSUPER-Con 65.05±1.42 45.35±2.22 0.70±0.42 pSUPER-hDcR3-1 71.72±2.04 21.71±3.28 0.30±0.48*pSUPER-hDcR3-2 70.33±2.32 26.20±2.82 0.37±0.21*

圖2 RT-PCR方法檢測siRNA對SW480中DcR3 mRNA表達的作用Fig.2 Effects of RT-PCR on siRNA DcR3 mRNA expression in SW480

2.3 Dcr3 siRNA對SW480中DcR3的蛋白質表達的抑制作用

收 集 pSUPER-hDcR3-1、pSUPER-hDcR3-2和pSUPER-Con瞬時轉染后48 h的SW480細胞，提取總蛋白，Bradford法進行蛋白定量，上樣量為30g/孔，以GAPDH作為內參照，檢測細胞中DcR3的表達，實驗獨立重復3次，每組樣本例數為6。Western blotting結果顯示，轉染后pSUPER-hDcR3-1后細胞DcR3的蛋白質的表達顯著下降(P＜0.01);轉染pSUPER-hDcR3-2后，細胞DcR3蛋白質的表達也有顯著下調(P＜0.01)，表明針對DcR3的siRNA可以抑制DcR3的蛋白表達(圖3，表4)。

2.4 Dcr3 siRNA對SW480細胞生長的影響

MTT試驗結果顯示，pSUPER-hDcR3-1組的吸光值為0.762±0.051(n=6)，48 h細胞存活率為51%;pSUPER-hDcR3-2組的吸光值為0.737±0.048(n=6)，48 h細胞存活率為48%，與pSUPER-Con組的吸光值為0.842±0.061(n=6)，48 h細胞存活率79%相比差異有統計學意義(P＜0.01)。

表4 siRNA對SW480中DcR3蛋白質表達的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of siRNA on protein expression of DcR3 in SW480(±s，n=6)

表4 siRNA對SW480中DcR3蛋白質表達的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of siRNA on protein expression of DcR3 in SW480(±s，n=6)

* P＜0.01 vs pSUPER-Con group;DcR3:decoy receptor 3.

Group GAPDH DcR3 Relative expression quantity pSUPER-Con 147.12±5.27 59.64±3.77 0.41±0.04 pSUPER-hDcR3-1 140.28±3.38 17.87±2.86 0.13±0.02*pSUPER-hDcR3-2 149.70±6.21 24.02±1.29 0.16±0.03*

圖3 Western blotting檢測SW480中DcR3的表達Fig.3 Western blotting method for detection DcR3 expression in SW480

3 討論

TNFR超家族新成員DcR3與TNFR基因超家族成員有同源性的EST，從人胚胎肺中分離出一條新的全長 cDNA，DcR3 mRNA全長1.2 kb，加工成熟的DcR3蛋白由271個氨基酸組成，其相對分子質量約35 000［4］。

研究［5-6］表明，DcR3表達于某些人類正常組織包括腦、肝、肺及成人脾、胃腸道和臍帶靜脈內皮細胞中，在肺癌、胃腸道腫瘤、腦惡性膠質瘤、胰腺癌和肝癌等惡性腫瘤組織中都有不同程度的高度表達。DcR3通過和腫瘤壞死因子超家族成員配體LIGHT、Fas/FasL和 TL1A競爭性結合，從而抑制 LIGHT、FasL、TL1A介導的細胞凋亡、T細胞增生等，并呈劑量依賴性，使腫瘤細胞逃逸肌體免疫系統的清除及細胞凋亡，促進了腫瘤的發生和發展，與某些腫瘤的發病有關。并且，DcR3還通過阻斷TL1A的作用而誘導腫瘤血管形成，促進腫瘤的發生［7］。因此，DcR3在抗凋亡和免疫調節中的獨特作用以及在許多人類惡性腫瘤中的高度表達決定了其與惡性腫瘤的發生、發展及預后密切相關。

鑒于DcR3在結腸癌細胞中高表達，本課題組構建了表達DcR3 siRNA的重組質粒pSUPER-hDcR3，以細胞轉染技術將包含特異性DcR3 siRNA的質粒成功轉染人結腸癌細胞系SW480后，通過阻斷與其特異性互補的mRNA表達，阻止其翻譯成蛋白質，用RTPCR、Western blotting實驗證實結腸癌細胞DcR3的分泌量明顯減少，MTT實驗結果顯示siRNA各組對細胞增生有不同程度的抑制效，說明本文所構建pSUPER-hDcR3重組質粒在結腸癌細胞中能與DcR3的mRNA特異性結合，從而使其翻譯程序停止。siRNA可作為一種調控特定基因表達的手段，并且可按劑量來調節特定基因的表達或功能，具有安全性高、特異性強、作用確切的特點。盡管目前存在siRNA專一性轉移、在體內進入靶細胞前降解等諸多問題尚不能完全解決，但具有強效抑制作用的siRNA可解除DcR3對FasL、LIGHT及TL1A三大調節系統的抑制，從而使機體正常發揮清除腫瘤細胞及活化免疫細胞的功能，對腫瘤基因治療仍具有很大價值。有研究［8-9］證實通過封閉DcR3的基因表達可能使腫瘤細胞趨向凋亡。抑制后生物學效應對于siRNA來說，意義更為顯著，本研究為進一步探討封閉DcR3基因表達可否使腫瘤細胞凋亡而起到治療腫瘤的作用、是否與抗癌藥物具有協同作用奠定了實驗基礎。

總之，應用DcR3的特異性SiRNA抑制DcR3基因表達，通過測定DCR3的mRNA及蛋白表達量，為進一步深入了解DcR3在體內作用的相關機制，以及對腫瘤患者病情進展的檢測、復發轉移及預后的估計提供體外實驗基礎，并對開發相關生物制劑逆轉腫瘤細胞對肌體免疫的逃避，開辟腫瘤預防與治療的新領域，具有重要理論和實際意義。

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