瑞舒伐他汀對晚期內皮祖細胞增生、遷移及凋亡的影響

盛 瑾 劉文嫻 李 鵬

(首都醫科大學附屬北京安貞醫院心內科監護室，北京100029)

1997年，Asahara等［1］從人外周血中分離得到一類具有內皮細胞及祖細胞特性的細胞，將其命名為內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)。隨后發現根據細胞形態、表面標記和增生能力的不同，EPCs分為早期 EPCs和晚期 EPCs［2］。大量的動物和臨床試驗［3］表明，EPCs是維持內皮完整性和血管自身平衡的重要部分。晚期EPC較早期EPCs形成管腔能力和增生能力更強，可最終生成血管內皮細胞，參與血管新生，修復受損內皮的功能可以更好的促進心肌梗死后心肌的修復。作為新一代的他汀藥，瑞舒伐他汀已經被證實擁有更強的降脂及穩定、部分逆轉粥樣斑塊和改善血管內皮功能的治療價值［4］，但其是否對晚期EPCs的功能具有改善作用，國內外相關研究較少，因此我們進行本項研究，探討不同濃度、不同作用時間瑞舒伐他汀對晚期EPCs的增生、遷移和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材

1.1.1 試劑

EPC培養基(endothelium basis medium 2，EBM-2;美國Sigma公司)，胰蛋白酶和胎牛血清(美國Gibco公司)，人纖維連接蛋白(美國Sigma公司)，人淋巴細胞分離液(英國Amersham Pharmacia公司)，FITC標記的荊豆凝集素(FITC-ulex europaeus agglutinin，FITC-UEA-I;美國Sigma公司)，Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acetylated low density lipoprotein，Dil-acLDL;美國Molecular Probe公司)，苯基四氮唑溴鹽(華美生物工程公司)，二甲基亞砜(美國Sigma公司)，Transwell小室(美國 Sigma公司)，TUNEL試劑盒(美國 羅氏公司)，瑞舒伐他汀(阿斯利康公司)。

1.1.2 主要器材

熒光倒置顯微鏡(德國 Leica 4000B型)，熒光正置顯微鏡(日本OlympusBX-51)，CO2細胞培養箱(日本三洋公司產品)，酶標檢測儀(德國 Beckman公司)，超凈工作臺(北京昌平長城凈化空氣儀器廠)，離心機(上海安亭科學儀器廠TGL-16C)。細胞培養板、離心管、培養皿等耗材購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 研究對象

健康雄性Wistar大鼠，體質量180～220 g，8～12周，購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，實驗動物許可證號:13706。

1.2.2 晚期EPCs的培養和分離

將健康Wistar大鼠處死后，取下肢長骨骨髓，加到淋巴細胞分離液中，離心，吸取單個核細胞層，置入EBM-2中，重懸細胞，然后接種于纖維連接蛋白預包被的6孔板中。每隔2 d換液，用PBS洗除非貼壁細胞，繼續培養至28 d，再加PBS洗除非貼壁細胞，實驗時取對數生長期細胞［5］。

1.2.3 細胞染色及鑒定

在細胞培養第28 d，用體積分數4%多聚甲醛固定，洗滌，應用體積分數0.1%Triton-100打孔，將貼壁細胞與 Dil-acLDL(2.4 mg·L-1)孵育;將 FITCUEA-I(10.0 mg·L-1)加入標本中，孵育1 h，最后用體積分數50%甘油封片，應用熒光顯微鏡觀察。鏡下Dil-acLDL染色細胞呈紅色，FITC-UEA-I染色細胞呈綠色，DAP染色細胞I呈藍色，3種染色均為陽性的細胞可鑒定為正在分化的晚期EPCs。

1.2.4 試驗分組及藥物干預

1)藥物配制:瑞舒伐他汀以無水乙醇溶解后，再加入與瑞舒伐他汀等摩爾的NaOH，50℃水浴2 h，調整pH值至7.20，過濾除菌，調節濃度至0.001、0.01、0.1、1.0、10、100 μmol/L 備用。

2)試驗分組:(1)他汀不同濃度組:①對照組:以不含瑞舒伐他汀培養基與EPCs共培養，共培養時間與實驗組一致。②實驗組:以含不同濃度瑞舒伐他汀的培養基(分別為 0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L)與晚期EPCs共培養24 h。(2)他汀共培養不同時間組:①對照組:以含0.1 μmol/L瑞舒伐他汀的培養基與晚期EPCs共培養0 h。②實驗組:以含0.1 μmol/L瑞舒伐他汀的培養基與晚期EPCs共培養不同時間 (分別為 1、3、6、12、24、48 h)。

1.2.5 晚期EPCs增生能力的檢測

將同等數目的晚期EPCs(2×103)接種于96孔板，每孔加培養液100 μL，培養24 h細胞貼壁后分別加入不同濃度的瑞舒伐他汀，每組設4個復孔，設不加藥物的陰性對照組;繼續培養24 h后，加入體積分數5%苯基四氮唑溴鹽10 μL，繼續培養4 h;加二甲基亞砜100 μL，室溫下脫色搖床上振蕩10 min溶解，置酶標檢測儀測定450 nm處的吸光度(A)，比較各組間的增生功能的差異。

1.2.6 晚期EPCs遷移能力的檢測

將同等數目的晚期 EPCs(2×104)懸于100 μL培養液中，注入Transwell小室的上室;將含有血管內皮生長因子(50 μg·L-1)的500 μL培養液加入到下室，孵育24 h后取出，刮去上層未移動細胞，用體積分數4%多聚甲醛固定10 min，Giemsa染色30 min，去離子水清洗后晾干，倒置顯微鏡下隨機選擇3個連續高倍視野(200×)，計數遷移至底層的EPCs，比較各組間遷移功能的變化。

1.2.7 晚期EPCs凋亡能力的檢測

應用TUNEL試劑盒進行凋亡檢測:用4%的多聚甲醛固定1 h，PBS緩沖液漂洗，加入3%H2O2阻斷液20℃作用10 min，加穿孔液于4℃作用30 min，加50 μL TUNEL反應混合液，加覆蓋膜，濕盒中37℃作用1 h，加50 μL 轉換POD 溶液，加50 μL DAB 底物，避光顯色1～2 min，根據顯色情況及時用PBS漂洗后在顯微鏡下觀察。TUNEL陽性的細胞比例由在3個不同的視野數至少200個細胞來確定。重復試驗3次。

1.3 統計學方法

應用SPSS 13.0軟件進行數據處理及分析，實驗數據用均數±標準差(±s)表示，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，計數資料多組間比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 晚期EPCs的生物學特征

培養2 d后大部分(70% ～80%)早期EPCs貼壁;細胞呈圓形，體積較小(圖1A);培養至第7～8天，細胞體積增大，透亮度增強，呈現梭形早期EPCs(圖1B);第27～28天，呈現鋪路石樣晚期EPCs(圖1C)。

圖1 光鏡下早期EPCs與晚期EPCs的細胞形態Fig.1 Cell morphology of early EPCs and late EPCs in optical microscope

2.2 晚期EPCs的熒光染色鑒定

晚期EPCs具有吞噬功能，可吞噬Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)以及FITC標記的荊豆凝集素(FITC-UEA-I)。在熒光顯微鏡下，Dil-acLDL呈紅色(圖2A)，FITC-UEA-I呈綠色(圖2B)，DAPI細胞核染色呈藍色(圖2C)。據此，可鑒定為正分化的晚期EPCs(圖2D)。

圖2 晚期EPCs熒光染色鑒定Fig.2 Fluorescent staining demonstrated late endothelial progenitor cells

2.3 瑞舒伐他汀對晚期EPCs增生功能的影響

MTT法檢測晚期EPCs增生功能變化，結果顯示:與對照組(A值為0.227±0.006)相比，加入不同濃度瑞舒伐他汀(分別為 0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L)培養細胞24 h后，均能改善 EPCs的增生活性(P＜0.05)。EPCs的增生活性在0.1 μmol/L組增加最明顯(P＜0.01)，并且0.1 μmol/L組與其他各組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。而當繼續增加瑞舒伐他汀濃度時，EPCs的增生活性反呈下降趨勢，但100 μmol/L組(A值為0.274±0.010，P＜0.01)仍高于對照組(圖3A)。

0.1 μmol/L瑞舒伐他汀處理晚期EPCs持續不同時間(分別為 1、3、6、12、24、48 h)后，除 1 h 組與對照組相比差異無統計學意義外，細胞的增生功能隨處理時間的延長而增強，顯示了時間依賴性(P＜0.05)，48 h效果最強(A值為0.300±0.008，P＜0.01)(圖3B)。瑞舒伐他汀可顯著地改善晚期EPCs的增生功能，且呈濃度依賴性(F=64.11，P＜0.01)和時間依賴性(F=62.22，P ＜0.01)。

圖3 瑞舒伐他汀對晚期EPCs增生功能影響Fig.3 Effects of rosuvastatin on late EPCs proliferation

2.4 瑞舒伐他汀對晚期EPCs遷移功能的影響

采用Transwell小室檢測瑞舒伐他汀對晚期EPCs遷移功能的影響，發現各濃度(分別為0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L)瑞舒伐他汀共培養 24 h后均明顯改善EPCs的遷移功能(P＜0.05)。當濃度為0.1 μmol/L時，瑞舒伐他汀改善作用最強(P＜0.01);當隨濃度增高，改善作用無明顯提高;而當繼續增加瑞舒伐他汀濃度時，EPCs的增生活性反呈下降趨勢，與濃度為0.1 μmol/L時相比，濃度為100.0 μmol/L的瑞舒伐他汀提高晚期EPCs的遷移功能差異無統計學意義(P=0.06)(圖4A)。

當濃度為0.1μmol/L的瑞舒伐他汀與晚期EPCs共培養(分別為 1、3、6、12、24、48 h)不同時間后，其明顯提高晚期 EPCs遷移功能;與對照組相比(N=22.2±3.2)，提示細胞的遷移功能隨處理時間的延長而增強，顯示了一定時間依賴性(P＜0.05)，24～48 h效果最佳，與對照組相比(N=22.2±3.2)，共培養48 h后，其遷移功能顯著提高(N=48.6±3.4，P＜0.01)(圖4B)。瑞舒伐他汀可顯著改善晚期EPCs的遷移功能，且呈濃度依賴性(F=16.83，P＜0.01)和時間依賴性(F=54.64，P ＜0.01)。

2.5 瑞舒伐他汀對晚期EPCs凋亡功能的影響

TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡功能，結果為:當共培養24 h后，瑞舒伐他汀濃度自0.001 μmol/L～100.00 μmol/L均能增強EPCs抗凋亡能力(P＜0.05)，隨濃度升高，瑞舒伐他汀降低凋亡功能增強;當濃度為0.1 μmol/L時，晚期EPCs凋亡率最低(P＜0.01);但隨濃度進一步升高(分別為1.0、10.0、100.0×10-4μmol/L)，凋亡率無明顯降低(圖5A)。濃度為100.0 μmol/L和濃度為0.1 μmol/L的瑞舒伐他汀，對晚期EPCs凋亡功能降低程度相似(P=0.22)。當濃度為0.1 μmol/L時，與對照組(凋亡率為33.22±0.91)相比，瑞舒伐他汀隨培養時間延長(分別為 1、3、6、12、24、48 h)均可改善晚期EPCs的凋亡功能。當共培養6 h，瑞舒伐他汀可顯著降低細胞凋亡(凋亡率為26.96±0.81，P＜0.01)，但此時較共培養48 h的凋亡率無明顯變化(P=0.06)。說明處理需持續一段時間才會對改善細胞凋亡有影響，隨處理時間的延長抑制凋亡的作用能得到一定程度的改善，但繼續延長時間抑制作用進入平臺期，未得到進一步增強(圖5B)。瑞舒伐他汀可顯著降低晚期EPCs的凋亡功能，且具有濃度依賴性(F=31.20，P ＜0.01)和時間依賴性(F=69.33，P ＜0.01)。

3 討論

EPCs主要存在于骨髓，也可來源于外周血、脾臟、脂肪等組織。主要功能是促進血管新生和維持內皮功能;與早期EPCs相比，晚期EPCs更成熟，增生能力更強，分泌更多一氧化氮(NO)，形成新生血管能力更強［6］。本實驗發現，培養2 d后細胞呈圓形、體積較小的單個核細胞;第7～8天時，變為梭形的早期EPCs，28 d時出現鋪路石樣的晚期EPCs;且可吞噬熒光染料FITC-UEA-I和Dil-acLDL，因此可鑒定為晚期EPCs。

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)、高血壓、糖尿病等患者的晚期EPCs數量減少、功能受損［6-8］，HMGCoA還原酶抑制劑(即他汀類藥)除了抑制膽固醇合成外，他汀類藥物還有很多有益的心血管保護作用，例如改善內皮功能異常、增加一氧化氮(N0)生物利用率［9］。他汀對于內皮功能的改善作用已被實驗證實，但機制尚待研究。而瑞舒伐他汀作為新一代的他汀已經被證實擁有更強的降脂效果及穩定、逆轉粥樣斑塊，改善血管內皮功能的治療作用［10］，Werner等［3］觀察到給予小鼠瑞舒伐他汀，其外周血循環早期內皮祖細胞計數在用藥后24 h即有明顯升高并持續到用藥24 h后。同時瑞舒伐他汀明顯促進頸動脈損傷的再內皮化并抑制血管內膜的過度增生。試驗證明了瑞舒伐他汀能增強晚期EPCs增生、遷移的功能，抑制細胞的凋亡。與傳統他汀如辛伐他汀、洛伐他汀相比，無需經肝臟代謝轉化為活性二羥酸，因此可直接以非前體藥物應用。

Llevadot等［11］發現，0.1μmol/L 辛伐他汀可明顯改善早期EPCs的增生功能達19%(A值，0.47±0.04 vs 0.56±0.03;P＜0.01)，提高其遷移能力達12倍(細胞計數，5 ±4 vs 64 ±26;P ＜0.01);Loomans等［12］發現，0.1 μmol/L阿托伐他汀可將高血糖模型小鼠骨髓來源早期EPCs的數量恢復至正常(增加30% ～40%)。與Llevadot研究相比，本試驗發現，瑞舒伐他汀改善晚期EPCs增生功能的作用更強(33%)，也可提高細胞的遷移功能，證明瑞舒伐他汀能夠明顯提高晚期EPCs增生、遷移的功能，減少細胞的凋亡，體現了細胞功能的改善與藥物濃度及作用時間的相關性。說明瑞舒伐他汀較傳統他汀對EPCs同樣存在保護作用，可以通過促進新生血管的形成而促進心肌梗死后心肌修復，為他汀類藥物的心血管保護機制提供了更豐富的理論基礎。但由于既往實驗多為早期EPCs，故在改善EPCs細胞功能方面，瑞舒伐他汀是否優于傳統他汀，還需要進一步研究實驗證明。

本實驗發現雖然高濃度(100 μmol/L)時瑞舒伐他汀細胞功能仍較對照組強，但隨著濃度增加，高劑量的瑞舒伐他汀對晚期EPCs的保護作用已經降低。因為本實驗為體外實驗，與臨床實驗差距較大:首先實驗對象為大鼠的內皮祖細胞，非人類的內皮祖細胞;其次本實驗中瑞舒伐他汀直接處理細胞，而體內實驗代謝較復雜，口服藥量與血藥濃度的關系估算困難，而且大鼠與人類的用藥量或血藥濃度關系直接以體質量換算可能欠妥，故本實驗未能給出臨床上瑞舒伐他汀的血藥濃度與0.1 μmol/L這個最佳濃度的關系。但在相關臨床研究中Hristov等［13］發現，冠心病患者高劑量(40 mg/d)、長期應用(＞8周)他汀后，外周血中早期EPCs數量明顯減少，且與他汀劑量明顯相關。同樣提示臨床加大他汀藥物劑量與血管內皮功能的改善可能不成正比。

受實驗條件及時間限制，本實驗未能涉及瑞舒伐他汀對晚期EPCs功能影響的機制問題。但現有實驗發現，傳統他汀可通過多種機制改善EPCs的功能，如:通過增多Akt磷酸化和NO量，改善體外培養的早期EPC的增生、遷移功能，降低凋亡水平［14］。但既往研究［15-17］多針對早期EPCs，且不同研究中所采用的藥物及濃度不同，處理時間、實驗方法也存在很多差異，實驗結果亦不統一，因此關于瑞舒伐他汀對晚期EPCs功能影響的機制是否與既往文獻一致尚需進一步證實。

結論:瑞舒伐他汀能夠提高晚期內皮祖細胞的增生、遷移功能，減少細胞的凋亡，且具有一定的濃度及時間依賴性。

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