乙醇通過激活JNK和p38K引起成神經瘤細胞死亡

文 勇 Yongil KWON 于 順

(1.南首爾大學公共衛生管理部，天安331-707;2.翰林大學江東圣心醫院婦產科，首爾150-030;3.首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室，北京100053)

長期飲酒可以造成多種器官損害，包括肝臟［1］、胰腺［2］和大腦［3-4］。體外研究［5-7］也證明，乙醇可以引起多種細胞凋亡。然而，乙醇引起細胞凋亡的早期信號傳導機制卻不甚清楚。絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)在指導細胞對各種刺激產生反應中發揮重要作用，參與調節多種細胞活動，如增生、分化和凋亡［8］。MAPK信號通路包括3個重要通路［8-9］:①細胞外信號調節激酶，即ERK通路;② c-jun N-末端激酶，JNK通路;③ p38 MAPK(p38K)通路。ERK1和ERK2是增生信號的主要傳感器，主要被絲裂原活化。而JNK和p38K則主要被引起細胞應激的各種刺激激活。研究［8-9］表明，JNK和p38K可以介導損害性刺激引起的細胞凋亡。然而，它們在乙醇誘導的細胞凋亡中的潛在作用還未見報道。

本研究將利用培養SK-N-SH成神經瘤細胞研究JNK和p38K通路在乙醇誘導的細胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SK-N-SH細胞(American type culture collection，USA);DMEM培養基(fisher bioblock scientific，France);MTS溶液(Promega，USA);抗JNK和磷酸化JNK以及抗p38K和磷酸化p38K抗體(Santa Cruz，USA);辣根過氧化物酶標記山羊抗兔和山羊抗鼠IgG(Vector Laboratories，USA);ECL 顯色 液(Promega，USA);caspase-3熒光底物Ac-DEVD-AMC(BD Pharmingen，USA);胎牛血清(Gibco，USA)。

1.2 細胞培養

SK-N-SH細胞在含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養基中于37℃培養箱中培養。培養箱充以5%CO2和95%空氣。

1.3 細胞死亡率測定

向乙醇處理后細胞培養基中加入20 μL MTS(5 g/L)溶液，孵育4 h，于490 nm波長處檢測各孔的光吸收值。細胞死亡率=對照細胞吸收值-乙醇處理細胞吸收值/對照細胞吸收值×100%。

1.4 DAPI染色

細胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，用PBS洗去固定液，然后加DAPI溶液(0.5 ng/L)染色3～5 min。封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察染色的細胞核。

1.5 DNA片段分析

DNA片段分析采用半定量連接反應介導的DNA平端方法進行［10］。

1.6 Caspase-3活性測定

制備全細胞勻漿，將細胞勻漿(50 ng/L)與caspase-3熒光底物Ac-DEVD-AMC反應。用熒光讀板機于360 nm激發光和450 nm發射光處測定熒光值。

1.7 免疫印跡分析

全細胞提取物或胞質組分 (50～100 μg)用PAGE分離并轉印到PVDF膜，然后分別與針對不同蛋白的 1抗體(phospho-JNK，JNK，phospho-p38 kinase，and p38 kinase protein)及相應的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(1∶5 000)孵育。辣根過氧化物酶活性用ECL試劑盒檢測。

1.8 統計學方法

采用SPSS 12.0軟件進行統計分析。所有實驗均重復5次。計量數據采用均數±標準差(±s)表示，多組間均數比較用單因素方差分析方法和均數多重比較方法，2組間均數比較用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乙醇對細胞形態和存活率的影響

如圖1A所示，未經乙醇處理的對照SK-N-SH細胞在顯微鏡下有較高的密度，細胞呈梭型。乙醇(100 mmol/L)處理24 h的細胞在顯微鏡下密度較低，呈梭型的活細胞數量明顯減少，很多細胞收縮呈圓形，體積較小。MTS法測試結果表明，乙醇可以增加死亡細胞的數量，并且隨著乙醇劑量的增加，死亡細胞的數量也隨之增加，尤其是當乙醇的濃度由50 mmol/L增加到100 mmol/L時，細胞死亡的百分率增加顯著(圖1B)。

圖1 乙醇對細胞形態和存活率的影響Fig.1 Effect of ethanol on cell morphology and viability

2.2 乙醇引起細胞凋亡樣改變

用100 mmol/L乙醇處理細胞后 12 h，引起caspase 3增高，并在所觀察的24 h內一直保持高水平(圖2A)。DNA片段分析表明，乙醇(100 mmol/L)處理24 h后，細胞核DNA出現斷裂的梯度樣改變，隨著時間進一步延長而愈加明顯(圖2B)。DAPI細胞核染色顯示，乙醇處理24 h的細胞，許多細胞的核呈碎裂現象(圖2C)。

2.3 乙醇引起JNK和p38K磷酸化

乙醇可以引起46 000和54 000磷酸化JNK表達增加，這一變化最早發生于乙醇處理后的1 h，并在4～16 h達到較高水平，此后有所回落。乙醇也引起磷酸化p38K表達增加，其最早變化也發生于乙醇處理后的1 h，并在4 h后達到高峰，隨后開始回落，詳見圖3。

2.4 JNK和p38K磷酸化抑制劑減輕乙醇引起的細胞死亡

乙醇引起的磷酸化JNK和p38K增高伴隨細胞死亡率的增加，而用磷酸化抑制劑 SP600125和SB203580分別抑制JNK和p38K的磷酸化后，則細胞的死亡率明顯降低(圖4)。

3 討論

本研究結果表明，乙醇可以引起SK-N-SH成神經細胞死亡，并表現為凋亡樣改變，包括caspase-3激活，細胞核碎裂以及DNA斷裂。這些結果提示，乙醇引起的細胞死亡形式主要是細胞凋亡。乙醇介導細胞凋亡的信號通路尚不十分清楚。JNK和p38K通路均屬于MAPK家族的成員，主要介導損害性刺激引起的細胞凋亡［8-9］。其中，JNK是細胞增生和凋亡不可或缺的。JNK激活是引起細胞增生還是凋亡取決于刺激的強度和激活的細胞類型。一般認為，瞬間的JNK激活促進細胞的生存，而持續性的JNK激活引起細胞凋亡［11］。另有研究［12］表明，p38K 激活對凋亡的影響也具有兩面性，其激活是促進細胞凋亡還是抑制凋亡取決于刺激的強度和細胞的類型。我們觀察了乙醇處理細胞JNK和p38K的活化及其與乙醇引起的細胞凋亡之間的關系。本研究結果表明，乙醇處理細胞的磷酸化JNK和p38K表達增加，提示JNK和p38K通路被激活。然而，JNK的激活持續時間較長，而p38K的激活時間比較短暫。這一結果提示，JNK通路在乙醇引起的SK-N-SH成神經細胞的死亡中起主要作用。我們利用JNK和p38K磷酸化抑制劑SP600125和SB203580分別抑制JNK和p38K磷酸化后，乙醇誘導的細胞死亡明顯受到抑制，進一步說明JNK和p38K通路在乙醇誘導的SK-N-SH成神經細胞的死亡中的作用。

本研究并不排除其他機制在乙醇引起的神經細胞死亡中的作用。例如，氧化應激、炎性反應和硫胺素缺乏等因素［13-14］。然而，本研究結果提示，乙醇引起的神經細胞退變的部分原因很可能與其直接激活JNK和p38K通路從而引起細胞損傷有關。

［1］Nanji A A，Tsukamoto H，French S W.Relationship between fatty liver and subsequent development of necrosis，inflammation and fibrosis in experimental alcoholic liver disease［J］.Exp Mol Pathol，1989，51(2):141-148.

［2］Hamamoto T，Yamada S，Hirayama C.Non-oxidative metabolism of ethanol in the pancreas;implication in alcoholic pancreatic damage［J］.Biochem Pharmacol，1990，39(2):241-245.

［3］Harper C，Matsumoto I.Ethanol and brain damage［J］.Curr Opin Pharmacol，2005，5(1):73-78.

［4］Baker K G，Harding A J，Halliday G M，et al.Neuronal loss in functional zones of the cerebellum of chronic alcoholics with and without Wernicke's encephalopathy［J］.Neuroscience，1999，91(2):429-438.

［5］McVicker B L，Buzas C J，Pacher P，et al.Alcohol and mitochondria in cardiac apoptosis:mechanisms and visualization［J］.Alcohol Clin Exp Res，2005，29(5):693-701.

［6］McVicker B L，Tuma D J，Casey C A.Effect of ethanol on pro-apoptotic mechanisms in polarized hepatic cells［J］.World J Gastroenterol，2007，13(37):4960-4966.

［7］Boyadjieva N I，Sarkar D K.Role of microglia in ethanol's apoptotic action on hypothalamic neuronal cells in primary cultures［J］.Alcohol Clin Exp Res，2010，34(11):1835-1842.

［8］Pearson G，Robinson F，Beers Gibson T，et al.Mitogenactivated protein(MAP)kinase pathways:regulation and physiological functions［J］.Endocr Rev，2001，22(2):153-183.

［9］Maroni P D，Koul S，Meacham R B，et al.Mitogen Activated Protein kinase signal transduction pathways in the prostate［J］.Cell Commun Signal，2004，2(1):5.

［10］Staley K，Blaschke A J，Chun J.Apoptotic DNA fragmentation is detected by a semi-quantitative ligation-mediated PCR of blunt DNA ends［J］.Cell Death Differ，1997，4(1):66-75.

［11］Davies C，Tournier C.Exploring the function of the JNK(c-Jun N-terminal kinase)signalling pathway in physiological and pathological processes to design novel therapeutic strategies［J］.Biochem Soc Trans，2012，40(1):85-89.

［12］Wagner E F，Nebreda A R.Signal integration by JNK and p38 MAPK pathways in cancer development［J］.Nat Rev Cancer，2009，9(8):537-549.

［13］Thomson A D，Guerrini I，Bell D，et al.Alcohol-related brain damage:report from a Medical Council on Alcohol Symposium，June 2010［J］.Alcohol Alcohol，2012，47(2):84-91.

［14］Crews F T，Nixon K.Mechanisms of neurodegeneration and regeneration in alcoholism［J］.Alcohol Alcohol，2009，44(2):115-127.