結(jié)腸癌中MMP-11和Moesin mRNA的表達與腫瘤轉(zhuǎn)移及預后的關(guān)系

張麗萍 蒲紅偉 陳 曉 李曉梅 競花蘭 劉小山*

(1.新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生化教研室，烏魯木齊830011;2.新疆醫(yī)科大學高職學院中心實驗室，烏魯木齊830011;3.中山大學中山醫(yī)學院法醫(yī)學教研室，廣州510080)

結(jié)腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是胃腸道中常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率在我國居全部惡性腫瘤的第4位，且近20年來發(fā)生率在持續(xù)上升［1］。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多階段的過程，研究［2-4］表明基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)和膜突蛋白(Moesin)在這個過程中起著非常重要作用，參與了腫瘤演進的多種病理過程。本研究通過檢測結(jié)腸癌組織中MMP-11和Moesin基因的表達情況，并探討二者在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1 資料和方法

1.1 組織標本

選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科1998～2004年手術(shù)切除的結(jié)腸癌石蠟包埋組織68例，其中男性35例，女性33例，患者年齡28～81歲，平均年齡62歲;正常組織40例為手術(shù)切端距癌組織5cm以上、經(jīng)組織學檢查證實的正常結(jié)腸黏膜。所有病例手術(shù)前均未接受化療、放射治療或免疫治療，術(shù)后予以輔助化療，臨床資料完整。

1.2 方法

采用原位雜交法檢測MMP-11和Moesin mRNA的表達，檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;所有手術(shù)切除標本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后行4 μm連續(xù)切片，HE染色;原位雜交染色按試劑盒說明書操作，光鏡觀察時用已知陽性結(jié)腸癌切片作陽性對照，0.01 mol/L PBS(pH7.4)代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷

MMP-11和Moesin mRNA表達均以細胞胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，且其著色強度高于背景非特異性染色。每例切片隨機選取5個高倍視野進行結(jié)果判斷，按染色強度及陽性細胞占腫瘤細胞總數(shù)的百分比綜合計分。結(jié)腸癌癌細胞陽性判定標準參照，分級方法如下:染色強度:不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽性細胞數(shù):小于5%為0分，5% ～25%為1分，26%～50%為2分，大于50%為3分。染色強度得分與陽性細胞數(shù)得分相乘，0分記為陰性(-)，1～3分記為弱陽性(+)，4～5分記為中度陽性(++)，大于或等于6分記為強陽性(+++)，進行統(tǒng)計學分析時(+～+++)皆為陽性。隨訪采取電話問詢，生存時間從手術(shù)日開始計算，末次隨訪為2009年9月。

1.4 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件包進行分析，采用 Kaplan-Meier法評估患者術(shù)后5年生存率，率的比較用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-11和Moesin mRNA在結(jié)腸癌組織和正常腸黏膜中的表達

MMP-11 mRNA在結(jié)腸癌組織中的陽性表達率為69.1%(47/68)，高于在正常結(jié)腸黏膜中的陽性表達率12.5%(5/40)(表1);Moesin mRNA在結(jié)腸癌組織中的陽性表達率60.3%(41/68)亦高于正常結(jié)腸黏膜中的陽性表達率10%(4/40)(圖1、2)。

圖1 MMP-11 mRNA在結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)中的表達Fig.1 Expression of MMP-11 mRNA in the cytoplasm of colorectal cancer

圖2 Moesin mRNA在結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)中的表達Fig.2 Expression of Moesin mRNA in the cytoplasm of colorectal cancer

2.2 MMP-11和Moesin mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達與臨床病理的關(guān)系

對68例患者結(jié)腸癌組織中MMP-11和Moesin mRNA表達和臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，Moesin mRNA在性別、年齡、民族、腫瘤大小、Dukes'分期、浸潤深度的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);在組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);MMP-11 mRNA在性別、年齡、民族、腫瘤大小、Dukes'分期的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);在組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表1 MMP-11和Moesin mRNA在正常結(jié)腸黏膜及結(jié)腸癌組織中的表達Tab.1 Expression of MMP-11 and Moesin mRNA in the normal colorectal mucosa and in colorectal cancer tissue n(%)

表2 MMP-11和Moesin mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達與臨床病理的關(guān)系Tab.2 Relationship between expression of MMP-11 and Moesin mRNA in colorectal cancer tissue and the clinical pathology n(%)

2.3 MMP-11和Moesin mRNA在結(jié)腸癌中的表達與預后的關(guān)系

在對68例結(jié)腸癌患者隨訪中因電話變更，有9例失訪，其余59例中MMP-11 mRNA陽性表達的患者5年生存率為46.8%，陰性者5年生存率75%，2者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表3 MMP-11和Moesin mRNA在結(jié)腸癌中的表達與預后的關(guān)系Tab.3 Relationship between expression of MMP-11 and Moesin mRNA in colorectal cancer and the prognosis n(%)

MMP-11陽性表達組與陰性表達組相比，前者5年生存率較高且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Moesin陽性表達組平均生存時間和中位生存時間都高于陰性表達組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(見圖5，6)。

圖5 MMP-11 mRNA表達組生存曲線Fig.5 Survival curves of the positive and negative expression groups of MMP-11 mRNA

圖6 Moesin mRNA表達組生存曲線Fig.6 Survival curves of the positive and negative expression groups of Moesin mRNA

3 討論

浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學特征，腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個比較復雜的過程，涉及腫瘤細胞的脫落、新生血管的長入及對細胞外基質(zhì)的降解等［5］。在組織學上，細胞基底膜完整性的破壞被認為是惡性腫瘤浸潤開始的一個標志。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類生物活性依賴于鋅離子、有降解細胞外基質(zhì)能力的內(nèi)肽酶家族［6］，在體內(nèi)主要參與細胞外基質(zhì)的降解或重構(gòu)、炎性反應(yīng)、缺血缺氧損傷等各種生理及病理過程［7］。MMP-11是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族的成員之一，定位于染色體22q11.23，其作用底物主要是基質(zhì)中的蛋白多糖和糖蛋白，能降解細胞外基質(zhì)和基底膜，可以導致細胞外基質(zhì)代謝平衡的失調(diào)，從而引發(fā)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移［8］。對人體多種腫瘤進行的研究［9］表明，在不同實體瘤中MMP-11有不同程度的增高，與腫瘤進展及預后相關(guān)。Schuetz C S等［10］通過配對分析9例乳腺原位癌和浸潤性癌，認為MMP-11是乳腺癌浸潤相關(guān)基因之一。Gonzalez L O等［11］證實MMP-11過表達與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系。Deng H等［12］通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法證實了MMP-11在胃癌中參與腫瘤細胞的增生和腫瘤的發(fā)展。Zhao Z S等［13］研究結(jié)果證實MMP-11 mRNA和蛋白水平在胃癌組織中均呈現(xiàn)出高表達，在進展期胃癌患者中表達更明顯。嚴冬等［14］對130例胃癌患者血清，采用RT-PCR及酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測MMP-11 mRNA及蛋白表達情況，結(jié)果顯示MMP-11 mRNA在胃癌患者外周血清中陽性表達率(68.4%)高于正常人群(5%)，尤其在根治術(shù)后轉(zhuǎn)移和(或)復發(fā)的晚期患者的外周血中，推測其可能作為胃癌診斷、復發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子標志物。

膜突蛋白(Moesin)屬 ERM(Ezrin，Radixin，Moesin)家族成員，表達Moesin分子的cDNA核苷酸長度為3 835個堿基，開放讀碼框內(nèi)有1 731個堿基編碼577個氨基酸。Moesin蛋白存在兩種構(gòu)象，激活的Moesin蛋白(磷酸化)作為橋梁分子，介導肌動蛋白與質(zhì)膜的交聯(lián)從而引發(fā)肌動蛋白骨架的重構(gòu)，促進細胞生長、遷移，所以Moesin蛋白在腫瘤發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色。已有研究［15］證明Moesin的表達程度與乳腺癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)。Kim C Y等［16］也證實Moesin在結(jié)腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移過程起重要作用，可作為結(jié)腸癌的診斷與判斷預后的生物標志。周勤等［17］采用免疫組化法檢測31例正常宮頸組織(NCE)、48例宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)及66例宮頸鱗癌組織(SCC)中Moesin表達，其表達水平顯著升高，在CIN組Moesin的表達隨病變程度加重而升高，且SCC組中與分期、浸潤深度、盆腔淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。劉暢等［18］認為甲狀腺乳頭狀癌組織中Moesin的高表達與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究利用原位雜交方法對結(jié)腸癌組織中Moesin和MMP-11 mRNA表達情況進行了研究，實驗結(jié)果顯示Moesin和MMP-11 mRNA在結(jié)腸癌陽性表達率分別為60.3%和69.1%，明顯高于正常結(jié)腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義。其中Moesin mRNA表達與性別、年齡、民族、腫瘤大小、Dukes'分期、浸潤深度無關(guān)，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期表達有關(guān)，該結(jié)果與李瑩杰等［19-20］在胃癌中的研究結(jié)果相符。MMP-11 mRNA表達與性別、年齡、民族、腫瘤大小、Dukes'分期差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，與組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期表達有統(tǒng)計學意義，組織分化差、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期高者MMP-11 mRNA表達率高，提示MMP-11在結(jié)腸癌中的表達隨Dukes分期增高而增加，在結(jié)腸癌的進展和分化過程中，分化程度越低，腫瘤細胞分泌MMP-11越多，其浸潤和轉(zhuǎn)移能力也越強，在腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，研究結(jié)果與Gonzalez L等［21］結(jié)果一致，因此本研究認為 MMP-11和 Moesin可以作為結(jié)腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移的預測指標;此外研究通過生存率分析結(jié)果顯示MMP-11 mRNA陽性表達的腫瘤患者5年生存率明顯低于陰性者，差異有統(tǒng)計學意義，提示MMP-11可以作為結(jié)腸癌判斷預后的生物學指標，而Moesin對結(jié)腸癌的預后影響還有待進一步研究。

綜上所述，Moesin和MMP-1 mRNA在結(jié)腸癌中均高表達且與臨床病理相關(guān)，提示上述生物學指標與臨床病理學指標相結(jié)合可能為結(jié)腸癌的診斷、病情監(jiān)測、預后判斷以及治療提供了嶄新的思路。

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