局灶性缺血預處理對大鼠腦梗死區周圍Toll樣受體4及核因子－κB表達的影響

胡曉松，唐 瑜，李 娟，劉馨蓮，孫 靜

臨床上許多疾病均可導致腦缺血的發生，隨著對腦缺血疾病研究的逐漸深入，腦缺血耐受 (brain ischemic tolerance，BIT)現象越來越受到人們的關注。目前認為給予1次或多次短暫、輕微 (亞致死量)的缺血缺氧刺激即腦缺血預處理(CIP)，可作為一種損傷性應激原刺激而有效調動機體自身的內源性保護機制，從而誘導BIT的發生，增加機體對下一次嚴重損傷的抵抗能力，但其作用機制目前仍不明了［1－2］。

Toll樣受體 (Toll－like receptors，TLRs)是一個介導天然固有免疫的古老家族，在感染性炎癥中扮演著重要角色。近來研究發現TLR4介導的信號通路，在非病原性炎癥中亦占有重要地位。本實驗通過研究TLR4及其靶基因蛋白核蛋白印跡法因子－κB(NF－κB)在CIP后腦缺血梗死區周圍的表達變化，旨在探討該信號通路在BIT誘導機制中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康7～8周的SD雄性大鼠，清潔級，體質量250～300 g，共45只。采用隨機數字表法將大鼠分為3組，CIP組:給予CIP 20 min，3 d后給予大腦中動脈阻塞(MCAO)2 h，再灌注6 h、24 h、72 h;MCAO組:未行CIP，單純暴露動脈處的解剖結構20 min(假手術)，余同CIP組;Sham組:兩次均為假手術，均暴露解剖結構，未進行缺血處理。每組各時間點5只。

1.2 動物模型的制備 參照并改良局灶－局灶性腦缺血預處理模型［3］制備方法，大鼠術前12 h禁食不禁水，以4%水合氯醛腹腔內注射麻醉 (7.5 ml/kg)，置仰臥位，于頸部行長約25.0 mm常規縱行切口。暴露并鈍性游離右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈 (ICA)及頸外動脈 (ECA)，結扎ECA遠側端，動脈夾夾閉CCA近心端，在結扎線近端距分叉5.0 mm處剪一約0.2 mm小口。取浸于2.5×106U/L肝素鈉的長6.0 cm、直徑0.26 mm、頭端圓鈍的尼龍線從ECA殘端插入，經CCA分叉部進入ICA(19.0±0.5)mm，直至感覺有阻力時，結扎ECA近心端。20 min后輕輕抽出栓線約10 mm形成第1次再灌注，固定尼龍線并全層縫合切口。3 d后再次麻醉大鼠，找到ECA結扎處，重新剪口插線阻斷大腦中動脈(MCA)，結扎ECA，并留置長約4.0 cm的尼龍線于體外，縫合皮膚。2 h后抽出栓線，形成第2次再灌注。

1.3 神經病學評分及MCAO模型成功的判斷標準 參照Longa等［4］神經病學評分標準:0分:無神經功能缺損癥狀;1分:輕度局灶性神經功能缺損 (不能完全伸展右前肢);2分:中度神經功能缺損 (向右側轉圈);3分:重度神經功能缺損(向右側傾倒);4分:不能自發行走，意識水平降低。MCAO模型成功標準:動物出現神經功能缺損，無煩躁不安、抬頭狂體征，評分為1～3分。

1.4 取材制片 大鼠腦缺血2 h，于再灌注預定時間點麻醉后，用0.9%氯化鈉溶液快速沖洗血管，迅速斷頭取腦，立即置于－20℃冰箱冷凍10 min，用腦切片器按2.0 mm厚度切片，選取距前囟點 (Bregma)0.6～1.4 mm的腦片行免疫組織化學染色。4%多聚甲醛固定12～24 h后行脫水、透明、石蠟包埋。切片厚度5 μm。其余腦片行0.1%四氮唑紅 (TTC)染色。

1.5 腦梗死體積比測定 將腦片浸入37℃的TTC染色后［5］，置于4%多聚甲醛中固定6 h。正常組織染成深紅色，梗死灶呈蒼白色。將固定的腦片按順序排列。拍照腦片前后兩面后輸入計算機，根據所測各腦片厚度以及梗死面積 (用于免疫組織化學的腦片的梗死面積和腦片面積分別以緊鄰其前后腦片的平均值近似計入)和腦片面積計算出梗死體積和前腦體積的近似值，得出TTC染色為蒼白區 (梗死區)占前腦體積的百分比。

1.6 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色采用即用型二步法，TLR4(1∶200，Abcam 公司) 及 NF － κB/P65(1∶500，Abcam公司)，二步法試劑PV－6002由北京中杉金橋生物公司 (美國Zymed公司分裝產品)提供。陰性對照用正常血清代替一抗。

1.7 蛋白印跡法 (Western blot)檢測 Western blot測定TLR4及NF－κB表達，取保存于液氮中的缺血半影區腦組織100 mg，剪碎，Radio免疫沉淀反應分析 (RIPA)裂解液裂解后冰浴下玻璃勻漿器中勻漿，離心半徑6.8 cm，12 000 r/min 4℃離心15min，取上清。Bradford法蛋白定量，每孔加樣量30 μg，7.5%SDS－PAGE電泳;蛋白轉膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%牛血清清蛋白 (BSA)的吐溫三羥甲基氨基甲烷緩沖液 (TBS/T)室溫封閉1 h，加兔抗大鼠TLR4(1∶100)、兔抗大鼠 NF－κB(1∶200)和兔抗大鼠 β－actin抗體(1∶1 000)，4℃反應過夜;取膜，TBS/T洗5 min×3次，加辣根過氧化物酶 (HRP)標記的羊抗兔IgG二抗孵育;電化學發光劑 (ECL)顯影，圖像使用Total Lab軟件灰度掃描，計算目的蛋白 (TLR4及NF－κB)與內參蛋白β－actin吸光度的比值。以上實驗重復3次，取均值。

1.8 圖像分析及統計學方法 陽性表達為結構完整、定位明確的著色較深 (棕褐色)的細胞。切片在統一放大倍數 (40×10)下，隨機選6個視野，輸入Image pro－plus 6.0圖像分析系統，記取平均陽性細胞數。計量資料以 (±s)表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗;以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦梗死體積比 Sham組未見梗死灶。MCAO組腦梗死灶位于基底節區靠近紋狀體外側區域及額頂部外側皮質。CIP組和MCAO組TTC染色均可見正常腦組織被染成紅色，而梗死區域呈蒼白色。梗死區與周圍正常腦組織界限清晰。結果顯示再灌注24 h、72 h時，CIP組腦梗死體積比與MCAO組比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 CIP組與MCAO組腦缺血再灌注不同時間點腦梗死體積比比較(x ± s，%)Table 1 Comparison of brain infarct volume at different time after reperfusion between CIP group and MACAO group

2.2 免疫組化染色 TLR4、NF－κB陽性細胞主要表達于缺血側胼胝體、紋狀體、大腦皮質等處的神經膠質細胞及神經元。Sham組僅見微血管壁及脈絡叢上皮、室管膜上皮等處的弱表達，TLR4陽性表達產物在細胞質。再灌注6 h起，MCAO組即見TLR4明顯表達，并達高峰。TLR4膠質細胞樣陽性細胞可見核腫脹及較短突起 (見圖1);NF－κB陽性表達產物在細胞核或細胞質，表達高峰于再灌注24 h出現。3組不同再灌注時間點的TLR4及NF－κB陽性細胞數比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05);其中MCAO組及CIP組各再灌注時間點TLR4及NF－κB陽性細胞數與Sham組比較，差異均有統計學意義 (P＜0.01);CIP組各再灌注時間點TLR4及NF－κB陽性細胞數與MCAO組比較，差異亦均有統計學意義 (P＜0.01，見表2)。

2.3 Western blot檢測結果 TLR4蛋白表達高峰出現于再灌注后6 h，而NF－κB則出現于再灌注后24 h(見圖2)。CIP組各再灌注時間點TLR4及NF－κB蛋白表達的相對吸光度值與MCAO組比較，差異均有統計學意義 (P＜0.01，見表3)。

圖2 不同再灌注時間點TLR4及NF－κB蛋白表達 (Western blot檢測)Figure 2 Expressions of TLR4 and NF－κB protein detected by Western blot at different time after reperfusion

圖1 缺血再灌注24 h時腦梗死區周圍的TLR4及NF－κB表達情況 (×400)Figure 1 Expressions of TLR4 and NF－κB around infarct area at 24 h after cerebral ischemia－reperfusion

表2 3組大鼠不同再灌注時間點TLR4及NF－κB陽性細胞數比較 (±s)Table 2 Comparison of numbers of TLR4 and NF－κB positive cells at different time after reperfusion in three groups

表2 3組大鼠不同再灌注時間點TLR4及NF－κB陽性細胞數比較 (±s)Table 2 Comparison of numbers of TLR4 and NF－κB positive cells at different time after reperfusion in three groups

注:與Sham組比較，*P＜0.01;與MCAO組比較，▲P＜0.01

組別 例數 TLR4陽性細胞數NF－κB陽性細胞數6 h 24 h 72 h Sham組 5 6.30±1.15 9.38±1.57 4.29±0.41 5.67±1.32 7.20±1.35 6.38±1.10 6 h 24 h 72 h CIP組 5 56.96±4.32＊▲ 43.44±3.84＊▲ 32.77±4.76＊▲ 31.98±3.26＊▲ 41.57±5.91＊▲ 24.36±3.42＊▲MCAO組 5 72.34±6.68* 60.57±5.96* 42.32±4.87* 43.44±5.24* 55.90±6.84* 37.61±2.57*F 277.37 193.08 126.23 141.44 112.54 189.06 P值值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 CIP組與MCAO組不同再灌注時間點TLR4及NF－κB蛋白表達的相對吸光度值比較 (±s)Table 3 Comparison of relative absorbance values of TLR4 and NF－κB protein at different time after reperfusion between CIP group and MACAO group

表3 CIP組與MCAO組不同再灌注時間點TLR4及NF－κB蛋白表達的相對吸光度值比較 (±s)Table 3 Comparison of relative absorbance values of TLR4 and NF－κB protein at different time after reperfusion between CIP group and MACAO group

組別 例數 TLR4蛋白表達NF－κB蛋白表達42±0.05 0.28±0.03 MCAO組 5 0.62±0.06 0.48±0.04 0.38±0.04 0.44±0.03 0.58±0.05 0.39±0.04 t 6 h 24 h 72 h CIP組 5 0.44±0.03 0.35±0.05 0.24±0.02 0.31±0.03 0.6 h 24 h 72 h 6.28 4.71 7.25 8.51 5.61 5.29 P值值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

BIT是機體對內外環境損傷刺激固有的應激和防御反應，也是迄今已知的內源性保護機制中作用最強大的，但其發生機制仍未闡明。近來，隨著TLRs在炎癥研究領域的不斷深入，TLRs信號通路在BIT中的作用也逐漸得到重視。目前已分別在人類及小鼠中發現11種、13種TLRs［6］，TLR4作為“門戶”蛋白啟動機體的炎癥鏈式反應，在Ⅰ型跨膜信號轉導受體家族TLRs中扮演著重要角色。TLR4通過與接頭蛋白MyD88及白介素 (IL)相關激酶 (IRAKs)的結合，可促使NF－κB移位，啟動與天然免疫及炎癥相關基因的轉錄，從而激活TLR4－MyD88依賴性的信號傳導通路［7］。

NF－κB是一種廣泛存在于真核細胞中的轉錄因子，屬于Rel蛋白家族，是多種損傷反應基因的多效調節因子。在靜息細胞中，它常與其抑制性蛋白I－κB結合存在于細胞質內。各種刺激引起I－κB磷酸化并被降解，導致I－κB與NF－κB解聚，引起NF－κB被激活并發生核轉位。活化的NF－κB通常以環狀的p65/p50異二聚體的形式進入細胞核，結合至DNA上的相應位點，調控下游含有NF－κB結合序列的靶基因的轉錄表達［8－9］，引起 IL－1、IL －6、IL －12、IL －8、腫瘤壞死因子α(TNF－α)及干擾素γ(IFN－γ)等細胞因子的釋放，并調節谷氨酸鹽受體，促進細胞凋亡、細胞內鈣超載、血－腦脊液屏障破壞等腦缺血損傷過程［10－14］。

本研究表明CIP能夠明顯減輕缺血再灌注24 h及72 h的腦梗死體積，20 min CIP可誘導BIT的發生，從而發揮對第2次腦缺血再灌注損傷的內源性神經保護作用。然而，本實驗也發現CIP并未導致再灌注6 h時的腦梗死體積比降低，我們推測這種遲滯現象可能與缺血半影區中星形膠質細胞的功能恢復、某些生成抗炎因子 (如IL－10等)的基因激活、局部血液循環的改善等均需一定的時程有關。

一般認為，非致死性的CIP刺激首先引起輕度的細胞和細胞外基質的損傷，釋放少量內源性配體，輕度激活TLR4信號通路，導致少量炎性遞質釋放，誘發輕微炎癥反應，同時上調抗炎因子、誘餌受體等的表達，抑制第2次嚴重腦缺血所誘發的強烈炎癥反應［15］。在藥物誘導BIT的研究中，有報道提示Oxymatrine等可通過下調TLR4、上調ERK信號通路發揮腦保護作用［16－17］。本實驗免疫組織化學染色及Western bolt檢測結果顯示CIP組各時間點TLR4與NF－κB陽性細胞數及相對吸光度值均明顯低于MCAO組同時間點相應各值，證實CIP可明顯抑制TLRs炎癥信號通路中的兩種重要蛋白TLR4與NF－κB的激活，結果表明該信號通路在BIT的發生過程中扮演著重要作用。此外，本研究也發現隨著腦缺血再灌注時間延長，TLR4蛋白與NF－κB的表達到達高峰的時間并不一致，TLR4在再灌注早期 (6 h)即達高峰，而NF－κB在再灌注后24 h才到達峰值，這可能主要與TLR4作為NF－κB的上游受體需先行激活有關。此外，是否存在其他炎性受體如TLR2、TLR9激活導致炎性因子NF－κB等大量表達的可能性，尚需進一步的研究。

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