中藥復方對小鼠嗎啡鎮痛耐受影響的研究

曹 陽，王文萍，郭雋馥，田振國

疼痛是癌癥患者特別是中晚期癌癥患者的主要癥狀，它比死亡更令患者恐懼和不安。阿片作為一類歷史悠久的鎮痛藥，嗎啡及其衍生物是臨床解除癌癥晚期疼痛的主要藥物。但是，嗎啡及其他阿片制劑長期使用會導致耐受性和依賴性，極大限制了其在臨床上的應用。嗎啡鎮痛耐受的機制已經研究了很多年，但至今尚不十分清楚。已經得到大多數人認同的機制有:受體數目變化、內吞;受體—蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)的活化;第二信號轉導通路的代償機制;受體基因表達變化等［1］。目前臨床上并無十分有效的防治嗎啡耐受的西藥，臨床所用多為嗎啡受體阻斷劑和作用稍弱一些的阿片類似物，但有不良反應多、降低嗎啡效果、產生新的依賴等問題。用中藥來解決嗎啡在使用中出現的耐受現象，尚屬于相對的空白階段，但由于嗎啡的耐受和依賴是同一藥物作用下的兩種不同表現方式和階段，與之相比，中醫、中藥在解決藥物依賴方面已經有200多年的歷史，且中藥具有多向調節、多功能、低毒無癮的優勢。故本實驗研究中藥復方對小鼠嗎啡鎮痛耐受的影響及其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源 選取2008年12月—2009年5月健康雄性昆明種小鼠30只 (由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供)，體質量21～23 g，替換掉其中尾部有缺陷的，隨機數字表法分為3組，即嗎啡組 (M組)、嗎啡加中藥復方組 (MB組)、正常對照組，每組10只。在安靜、室溫、正常光照的環境中適應性飼養1周，在此期間各籠條件均等、自由攝食飲水、無不良條件影響，1周后開始實驗。

1.2 儀器與試劑 SHA－B恒溫水浴振蕩器 (常州國華電器有限公司)，MDF－136超低溫冰箱 (日本SANYO)，CM1900石蠟切片機 (德國萊卡)，BS－51顯微鏡 (日本奧林帕斯)，WD－9413B紫外核酸分析系統 (北京六一儀器廠)，TGL－20M臺式高速冷凍離心機 (湘儀儀器有限公司)，gene analyse軟件 (北京六一儀器廠)。鹽酸嗎啡注射液 (沈陽第一制藥廠，批號070705，0.5 ml∶5 mg)，大黃、木香等中藥 (購自遼寧中醫藥大學附屬醫院眾意愿大藥房，藥材由遼寧中醫藥大學任艷玲教授鑒定)，兔抗PKA(由武漢博士德生物工程有限公司提供，產品編號BA1354)，DAB顯色試劑盒 (由武漢博士德生物工程有限公司提供，產品編號AR1022)，SABC免疫組化染色試劑盒 (由武漢博士德生物工程有限公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 中藥復方制備 精確稱取大黃75 g、木香50 g、當歸100 g，按下述操作濃縮至90 ml(2.5 g/ml)。當歸加木香提取揮發油后的藥液，水煎2次，1 h/次，合并煎液繼續濃縮。木香用水回流裝置提取揮發油 (提取揮發油所剩藥液回收后與當歸混合)。大黃水煎15 min并濃縮，按1∶1.5加入5%明膠，放置30 min后過濾，濾液中加入3～5倍的乙醇，過濾，除去明膠，濾液在70℃環境中使乙醇揮發完全。以上3種藥液混合，濃縮至90 ml(2.5 g/ml)。

1.3.2 嗎啡耐受模型的建立與給藥 小鼠飼養1周后開始給藥，M組每12 h皮下注射嗎啡10 mg/kg;MB組每12 h皮下注射嗎啡10 mg/kg并給予中藥復方0.2 ml/只。以上各組均給藥1周共15次。對照組未做任何處理。

1.4 甩尾潛伏期 (TFL)的測定 參照Yang等［2］的方法:第1次給藥前測量各組的基礎TFL。具體方法如下:將小鼠放入小鼠固定器中習慣5～10 min，將鼠尾末端3 cm置入52℃熱水中，測量小鼠尾部置入瞬間至甩出作用時間。隔5 min再測1次，取兩次平均值作為TFL。為避免燙傷，最長時間設為20 s，超過20 s以20 s計。隨后，分別在第1、3、6、9、12、15次給藥半小時后重復上述方法。

1.5 PKA免疫組化染色 待最后一次給藥并測定TFL后，立即于冰面上固定小鼠四肢，與左心室內注射4%多聚甲醛，直到小鼠尾部直硬，說明小鼠腦組織已經固定。立刻剪下小鼠頭部，取出腦皮質約100 mg用0.1低鈉磷酸鹽緩沖液 (MPBS)固定30～60 min→5℃組織脫水→包埋﹑切片→58～60℃烘烤→常規脫蠟至水→滅火內源性酶→熱修復抗原→滴加5%牛血清蛋白封閉液 (BSA)→遞加稀釋的一抗 (兔抗IgG)→滴加生物素化山羊抗小鼠IgG→DBA顯色→蒸餾水洗、脫水、透明、樹脂膠封片。利用奧林巴斯BS－51顯微鏡40倍物鏡進行觀察、拍照。每張片子采集2個高倍視野圖像，進行平均光密度測定。

1.6 統計學方法 采用SPSS 10.0統計學軟件進行統計處理，計量資料以 (±s)表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 M組和MB組不同時間TFL比較 M組與MB組給藥前、第1次、第3次給藥后TFL比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05);兩組第6次、第9次、第12次、第15次給藥后TFL比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 M組和MB組不同時間TFL比較 (±s，s)Table 1 Comparison of TFL of different time between two groups

表1 M組和MB組不同時間TFL比較 (±s，s)Table 1 Comparison of TFL of different time between two groups

組別 只數 給藥前 第1次 第3次 第6次 第9次 第12次 第15次47 9.40±0.19 7.52±0.33 6.44±0.39 MB組 10 4.22±0.43 16.65±1.01 16.21±0.40 15.14±0.37 13.27±0.45 10.44±1.02 8.81±1.18 t M組 10 4.30±0.49 16.59±0.83 16.18±0.46 14.04±1.1.333 0.333 0.500 2.717 3.148 2.651 2.631 P值值0.264 0.835 0.613 0.017 0.011 0.035 0.041

2.2 PKA免疫組化染色結果 正常小鼠腦皮質免疫組化染色顯示PKA幾乎沒有表達，M組PKA表達有所增多，MB組小鼠腦皮質內PKA明顯增多 (見圖1)。M組PKA染色平均光密度值為 (0.3492±0.0055)，MB組為 (0.3230±0.0096)，二者差異有統計學意義 (t=2.83，P＜0.05)。

3 討論

本研究結果顯示，中藥復方對小鼠嗎啡耐受形成有抑制作用，同時使用嗎啡和中藥復方可以取得更好的鎮痛效果。并且使用嗎啡和中藥復方的小鼠皮質中PKA明顯低于單獨使用嗎啡的小鼠，這與前面TFL統計結果相一致，并進一步證明中藥復方抑制小鼠嗎啡耐受形成的機制可能與拮抗了嗎啡對細胞內信號轉導系統的影響有關。

圖1 PKA免疫組化染色結果Figure 1 Immunohistochemical results of PKA

祖國醫學認為阿片辛香苦澀性溫，入十二經，功能行氣止痛，發散走竄，斂肺止咳，固精止遺，澀腸止瀉，有良好的臨床療效［3］。同時，阿片還有提攜氣血的興奮作用。多服久用阿片會導致成癮證。祖國醫學關于阿片耐受和依賴的病機理論主要有氣三焦受癮說、血津液受損說、膜原受邪說、五臟六腑受癮說、煙蟲說等［4］幾方面，其形成的主要機制是，煙毒內蘊，氣血津液受損，毒淤互阻，臟腑陰陽失調，損陰及陽，氣血淤滯，而見虛實互見，寒熱錯雜，諸病叢生的復雜病證。這些理論歷經數百年的實踐檢驗與不斷完善，為治療提供了充實的理論依據。嗎啡耐受和依賴是同一藥物作用下的兩種不同表現方式和階段，而中醫、中藥在解決藥物依賴方面已經有200多年的歷史。中醫藥學在長期的實踐中逐漸形成了一套源于中醫辨證論治理論，同時又以扶正祛邪為主要特色的治療原則。目前，用于對抗嗎啡耐受和依賴的中藥主要有清熱解毒類的中藥及補氣扶正、解痙鎮痛類的中藥。

由于嗎啡耐受機制是多系統的、復雜的，不能指望單靶點的藥物從根本上解決問題，所以中藥的多系統、多靶點作用越來越受到青睞。但同時也存在著復方制劑藥味多、處方龐大、基礎研究薄弱、有效成分與無效成分混雜、劑型過于單一、質量難以控制等問題，同時也難以對藥物進行深入的機制研究。基于以上，結合我國國情，發揮中醫藥的優勢，必須用現代的科技方法從中藥或復方中尋找治療嗎啡耐受的有效成分，進行深入研究，以研制出新藥物用于臨床，這也是中醫藥向現代化發展的要求。

1 Mercadante S，Fulffaro F.World Health Organization guidelines for cancer pain:a reappraisal［J］.Ann Oncol，2005，16(Suppl 4):132－135.

2 Yang W，Law PY，Guo X，et al.In vivo activation of a mutant muopioid receptor by antagonist:Future direction for opiate pain treatment paradigm that lacks undesirable side effect［J］.Proc Natl Acad Sci UAS，2003，1004(4):2117－2121.

3 宋樹立，高學敏.中醫辨證戒毒理論［J］.中國藥物依賴性雜志，2000，9(3):170－171

4 朱偉.阿片類藥物依賴的中醫認識與探討 ［J］.江西中醫藥，2002，10(5):29－30.