腎內血管緊張素系統在2型糖尿病大鼠的腎臟發育中異常活化的機制

孫永新，范愈燕，支楠，西山成，劉雅，黃雯，姚麗

（1.中國醫科大學附屬第一醫院康復科，沈陽 110001；2.香川大學醫學部藥理科，香川 671-0793，日本；3.首都醫科大學北京同仁醫院傳統醫學科，北京 100730；4.首都醫科大學北京同仁醫院腎臟內科，北京 100730；5.中國醫科大學附屬第一醫院腎臟內科，沈陽110001）

近來眾多的研究表明，腎素—血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）在糖尿病腎病的發生和發展中起到重要的作用。大規模的臨床試驗［1～3］證明，血管緊張素轉換酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑在臨床上的療效遠遠超出了其對控制血壓和改善血流動力學的影響，說明RAS是導致糖尿病腎病微量蛋白尿的重要原因之一。我們先前的研究也證明，糖尿病OLETF大鼠在糖尿病發生早期腎內血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）已經異常升高［4，5］。然而，對早期糖尿病肥胖動物模型中腎內RAS異常激活的具體年齡階段目前尚無報道。本研究中，我們為了明確腎內的RAS系統被異常激活的情況，觀察在糖尿病OLETF大鼠出生后第一天、哺乳期、斷奶后到成熟階段，腎臟發育過程中腎內AngⅡ含量及RAS系統組成成分基因表達水平的改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物：雌性妊娠晚期糖尿病OLETF大鼠和正常LETO大鼠均由日本大冢制藥公司提供（日本德島）。在雌性妊娠大鼠正常分娩后，取出生后第1、5和 14天及第 4、7、11、18和 30周的正常生長的雄性糖尿病OLETF大鼠和正常LETO大鼠斷頭取材，每組8～12只。

1.1.2 儀器：無創血壓檢測儀（BP-98A，日本Softron有限公司）；大鼠血糖檢測儀（日本Wako工業株式會社）；DNA擴增儀（OSO-406型，德國Biometra公司）。

1.1.3 試劑：尿中白蛋白檢測試劑盒（日本Shibayagi公司）；肌酐測定試劑盒（日本Wako工業株式會社）；PT-PCR的SYBR GreenⅠ和TaqMan探針檢測試劑盒（美國Applied Biosystems公司）；RNase-Free（美國Invitrogen公司）。

1.2 檢測項目

1.2.1 平均血壓測定和標本收集：在大鼠清醒狀態下通過無創血壓儀檢測平均血壓，取每只大鼠反復測定6次的平均值［6］；在大鼠生長過程中，從第6周開始每隔2周收集24 h的尿樣。大鼠斷頭后，左側腎臟的三分之一固定在10%的甲醛液體中保存，剩下部分分離出來的皮質經RNase-Free水處理后，保存在-80℃；右側腎臟快速在液氮中凍結后，-80℃保存。

1.2.2 腎臟指數測定：取腎后剝去脂肪等組織，用濾紙吸干表面液體，立即稱取右側每一個完整腎臟的濕重，并按每100 g體質量計算腎臟指數［6］。

1.2.3 實時定量PCR：檢測 GAPDH、腎素（renin）、血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）、血管緊張素轉換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）、血管緊張素Ⅱ受體1A亞型（angiotensinⅡreceptor type 1a，AT1AR）、血管緊張素Ⅱ受體1B亞型（angiotensinⅡreceptor type 1b，AT1BR）、血管緊張素Ⅱ受體2亞型（angiotensinⅡreceptor type 2，AT2R）、轉化生長因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，ColⅠ）、Ⅳ型膠原（collagen typeⅣ，ColⅣ）的基因表達，通過QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒、TaqMan ABI PRISM 7300實時PCR系統（美國Applied Biosystems公司）對來自各組大鼠腎臟皮質的cDNA模板進行定量擴增，所用引物同文獻［7，8］。每次進行PCR擴增時均采用等量的蒸餾水替代模板作為陰性對照，采用GAPDH作為加樣對照。所測目標基因mRNA的絕對值可通過以其GAPDHmRNA含量進行校正而獲得。

1.2.4 光學顯微鏡檢查：10%甲醛固定的腎臟組織，石蠟包埋，3 μm切片，采用PAS和Mass三色染色。通過自動圖像處理系統對PAS和Masson三色染色切片進行分析［6，9～11］，評估腎小球硬化和腎小管纖維化程度。

1.2.5 其他檢查：通過尿蛋白試劑盒和尿肌酐檢測試劑盒［6］檢測大鼠尿中白蛋白和尿肌酐濃度；餐后血糖水平測定采用Wako工業株式會社的血糖儀；尿中AGT檢測采用大鼠AGT的夾心酶聯免疫吸附試驗方法［10］；在腎內AngⅡ含量提取過程中，腎內組織在冷處理的甲醇中粉碎后，通過放射免疫方法檢測［6］。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般狀況和腎功能的影響

6～30周齡時，LETO大鼠的平均血壓（91～102 mmHg）和尿白蛋白/尿肌酐的比值（0.6～14.8 mg/g）無明顯變化（圖1A和1B）。糖尿病OLETF大鼠隨著年齡的增長發生高血壓（圖1A）；11～30周齡，糖尿病OLETF大鼠的尿白蛋白/尿肌酐的比值明顯高于LETO大鼠（P＜0.05，圖1B）。從7周齡開始，糖尿病OLETF大鼠體質量明顯高于LETO大鼠（P＜0.05，表1）。大鼠斷奶后（出生后2周），糖尿病OLETF大鼠右側腎質量/體質量的比值明顯高于LETO大鼠（P＜0.05，表1）。18～30周齡時，糖尿病OLETF大鼠的餐后血糖明顯高于LETO大鼠（P＜0.05，表1）。

2.2 RAS系統成分的改變

腎內AngⅡ含量的最高峰出現在糖尿病OLETF大鼠和LETO大鼠出生后第1天，從斷奶前到斷奶后（出生后1 d～4周）隨著年齡增長逐漸下降。從出生到4周齡，糖尿病OLETF大鼠和LETO大鼠比較，腎內AngⅡ含量和RAS組成成分AGT、renin、ACE、AT1AR、AT1BR、AT2R 的基因表達無明顯改變（P>0.05，圖 2A、2B、2C 和圖 3）。但是從 11周開始，糖尿病OLETF大鼠腎內AngⅡ含量明顯高于LETO大鼠（P<0.05），同時11～30周齡糖尿病OLETF大鼠AGT、renin的mRNA表達也明顯高于LETO大鼠（P<0.05，圖2B和2C）。糖尿病OLETF大鼠尿中AGT的排泄率與LETO大鼠相比，也從11周開始明顯增加，11周齡時分別為（358±14）和（80±11）ng/d，18 周齡時分別為（426±28）和（92±11）ng/d，30周齡時分別為（487±35）和（103±14）ng/d（均 P<0.05，圖 2D）。無論腎內 ACE還是 AT1AR和AT1BRmRNA水平，2組比較差異均無統計學意義（P>0.05，圖 3A、3B、3D）。然而，18～30周齡糖尿病OLETF大鼠與LETO大鼠比較，腎內AT2RmRNA

水平明顯降低（P<0.05，圖3C）。

表1 2組大鼠2～3 0周齡時的特征比較Tab.1 Characteristics of each group at 2-30 weeks of age

2.3 腎內皮質膠原、TGF-β和CTGF基因表達的改變

腎內皮質的ColⅠ、ColⅣ、TGF-β和 CTGF的基因表達如圖4所示，7～30周齡糖尿病OLETF大鼠CTGF基因表達水平是LETO大鼠2倍（P<0.05，圖4A）；與LETO大鼠比較，糖尿病OLETF大鼠TGF-β基因水平表達已開始逐漸升高，18～30周齡時迅速增加（P<0.05，圖4B）。同樣，糖尿病OLETF大鼠與LETO大鼠比較，18～30周齡及11～30周齡時腎內皮質的ColⅠ或ColⅣmRNA也分別明顯升高（P<0.05，圖 4C、4D）。另一方面，7～11周齡時 2組大鼠均無腎內免疫形態學改變。正如我們前期實驗所見［4］，18～30周齡糖尿病OLETF大鼠才出現了明顯的腎小球硬化和腎小管纖維化。

3 討論

我們在之前的研究中發現，OLETF糖尿病肥胖大鼠在發生糖尿病前腎內AngⅡ水平從11周已經開始顯著增加［4］。但是，我們不清楚在糖尿病OLETF大鼠的成熟過程中，糖尿病早期腎內AngⅡ水平是否已經開始異常增加。本研究發現，LETO和糖尿病OLETF大鼠在出生后到斷奶期間（從出生后第1天至4周齡），腎內AngⅡ水平在出生后第1天達到高峰，隨著年齡增長會逐漸下降，這與前人對正常SD大鼠腎內RAS的研究結果一致［12］。在第1天至4周齡，腎內AngⅡ水平在糖尿病OLETF大鼠與正常LETO大鼠之間沒有差異。同樣，在青春期開始（7周齡）時OLETF和LETO大鼠腎內AngⅡ水平無統計學差異。然而，在青春期（7～11周齡）期間，LETO大鼠腎內AngⅡ水平不斷下降，但是這種下降趨勢卻沒有在糖尿病前期OLETF大鼠中觀察到。這些數據表明，在糖尿病OLETF大鼠的糖尿病早期，腎內AngⅡ水平適當減少的發育缺陷會導致腎臟AngⅡ水平異常升高。

我們以前的研究發現，在糖尿病早期短期應用血管緊張素受體拮抗劑治療干預有助于減輕糖尿病OLETF大鼠的腎臟損傷。最近，對奧美沙坦和預防微量白蛋白尿的研究（ROADMAP）審查中發現，血管緊張素受體拮抗劑可以阻止微量白蛋白尿的發生［13］。這表明，如果2型糖尿病患者早期應用血管緊張素受體拮抗劑奧美沙坦治療，可以顯著減少微量白蛋白尿的發生率［13］。本研究發現，在青春期（18～30周齡）糖尿病OLETF大鼠腎內AngⅡ水平一直都維持在異常的高水平。這些數據支持一個假設，即異常的腎內AngⅡ水平調控了2型糖尿病腎病的發病，而早期應用血管緊張素受體拮抗劑治療可能在以后的生活中有效的預防糖尿病腎病的發生和發展，具有非常重要的意義。

從出生到斷奶期間（出生后第1天至4周齡），糖尿病OLETF和LETO大鼠腎皮質的AGT、ACE和renin基因表達沒有差異。同樣，在青春期開始（7周齡）時2組腎內RAS組成成分的基因表達沒有變化。然而到青春期的后期（11周齡），糖尿病OLETF大鼠的AGT和renin基因表達明顯高于LETO大鼠。巧合的是，這個時期的糖尿病OLETF大鼠腎內AngⅡ也同樣高于正常LETO大鼠。這些數據說明，糖尿病OLETF大鼠腎組織的AGT和reninmRNA異常高表達會導致青春期腎內AngⅡ水平異常升高的發育缺陷。然而，對于糖尿病大鼠腎內AGT和renin基因表達異常升高的具體病因機制不是很清楚，但是不能簡單的歸結于血糖升高。因為糖尿病OLETF大鼠表現出腎內AGT和renin基因異常高表達發生在青春期11周齡的糖尿病前期，早于血糖升高的糖尿病期。另外，糖尿病OLETF和正常LETO大鼠腎皮質中AT1受體的AT1AR和AT1BR基因表達沒有明顯差異。但是AT2R基因在糖尿病OLETF大鼠腎皮質中的表達明顯低于正常LETO大鼠，這些生理、病理變化需要進一步的研究。

據報道，TGF-β/CTGF所依賴的途徑可以激活包括膠原在內的細胞外基質蛋白化合物［14～16］。本研究發現，相對于LETO大鼠，OLETF大鼠在青春期（7或11周齡）CTGF、TGF-β和ColⅣ基因表達明顯增加。另一方面，ColⅠ基因在糖尿病OLETF大鼠18～30周齡時明顯增加，這與我們過去的研究結果一致［4］。本研究中，我們沒有觀察到糖尿病OLETF大鼠在青春期11周齡時腎組織免疫形態學發生改變，但腎臟功能已經輕微改變（如CTGF、TGF-β、ColⅣ），這可能是導致后期糖尿病腎病的重要病理基礎。

總之，本研究表明，糖尿病OLETF大鼠在青春期缺乏維持腎內低水平AngⅡ的發育缺陷是導致腎內AngⅡ異常升高的重要原因，與腎內AGT和renin基因的高表達密切相關。在糖尿病早期，腎內RAS異常激活可能是導致以后生活中糖尿病腎病發生發展的重要原因。

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