不同固定液對胃癌細胞骨架及連接蛋白熒光染色標記效果的比較

高建，鄭倩倩，李彥姝，周末

（中國醫(yī)科大學 1.實驗技術中心三部；2.基礎醫(yī)學院細胞生物學教研室，沈陽 110001）

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤細胞的侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要表現(xiàn)，也是導致進展期胃癌預后差的根本原因。上皮間質化在上皮來源的惡性腫瘤侵襲轉移過程發(fā)揮重要作用。細胞骨架的形態(tài)、結構、功能以及病理變化成為研究熱點［1～3］。近期研究報道，細胞骨架結構改變與上皮間質化發(fā)生相關［4，5］，上皮間質化發(fā)生后可使某些細胞間連接蛋白表達缺失或錯誤定位。微絲對細胞黏附、鋪展、運動、內吞、分裂具有重要調節(jié)作用。通過預染微絲來反映細胞骨架變化，已經成為人們研究細胞形態(tài)變化、腫瘤侵襲遷移的重要手段。本實驗主要采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察3種固定液對SGC-7901胃癌細胞的微絲和細胞連接蛋白Zo-1的影響，探討不同固定液對細胞骨架和連接蛋白固定效果，選擇最佳固定方法，為進一步研究胃腸腫瘤侵襲、轉移過程中細胞骨架結構改變及細胞間連接蛋白表達缺失或錯誤定位提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

胃癌細胞系SGC-7901為我校細胞生物學教研室保存。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司；Triton X-100，購自日本TaKaRa公司；BSA、FITC-Phalloidin、DAPI，購自美國 Sigma 公司；Zo-1-FITC，購自美國Invitrogen公司。激光共聚焦顯微鏡（FV-1000），購自日本OLYMPUS公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，購自美國Thermo公司。

1.2 SGC-7901細胞培養(yǎng)

SGC-7901細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化成單個，調整細胞濃度為1×105/mL和1×106/mL，分別接種于含蓋玻片的12孔板，培養(yǎng)12 h后細胞貼壁生長。

1.3 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察SGC-7901細胞在不同固定液處理下的微絲和連接蛋白

2種密度的細胞均分別用4℃預冷的4%多聚甲醛、2.5%戊二醛和95%乙醇室溫固定20 min，PBS沖洗3次，每次10 min。5%BSA（含0.2%Triton X-100）封閉透膜1 h。PBS沖洗3次，每次5 min。加入FITC-Phalloidin抗體于低密度細胞，室溫避光孵育1 h。Zo-1-FITC抗體加到高密度細胞，室溫避光孵育1 h。PBS沖洗3次，每次10 min。DAPI染核，室溫孵育15 min。PBS沖洗3次，每次10 min。60%甘油封片，用OLYMPUS FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡進行掃描，激發(fā)光波長為488 nm。

2 結果

2.1 用4%多聚甲醛固定的SGC-7901細胞骨架形態(tài)

4%多聚甲醛固定細胞進行熒光標記后發(fā)現(xiàn)，微絲結構完整，呈細絲拉網狀，層次清晰，有較強的立體感，胞質及胞核區(qū)干凈無非特異染色（圖1B）。與細胞核圖像融合后發(fā)現(xiàn)2種熒光無竄色現(xiàn)象（圖1C）。

2.2 用2.5%戊二醛固定的SGC-7901細胞骨架形態(tài)

用2.5%戊二醛固定細胞后，細胞微絲結構基本完整，在細胞的外周胞膜處可觀察到較完整的網絡體系，而細胞內部微絲熒光染色標記效果模糊，部分以高信號點狀結構出現(xiàn)在胞質及胞核周圍，不易分辨出清晰的網狀結構（圖2B）。疊加圖像亦清晰，無竄色現(xiàn)象（圖2C）。

2.3 用95%乙醇固定的SGC-7901細胞骨架形態(tài)觀察

細胞經過95%乙醇固定后形態(tài)欠規(guī)整，細胞外周微絲骨架結構略模糊。微絲纖維之間的區(qū)分不明顯，排列較亂，出現(xiàn)了類似核仁定位的綠色熒光信號非特異性高表達（圖3B）。

2.4 用4%多聚甲醛固定的SGC-7901細胞間連接蛋白形態(tài)

使用4%多聚甲醛固定處理細胞后，可觀察到細胞密集區(qū)出現(xiàn)Zo-1綠色熒光信號高表達，定位于鄰近細胞緊密連接處，細胞核區(qū)中空，細胞質見低表達的熒光信號（圖4B），疊加圖像可見Zo-1定位清晰，疊加染色無變化（圖4C）。

2.5 用2.5%戊二醛固定的SGC-7901細胞間連接蛋白形態(tài)

使用2.5%戊二醛固定細胞后，選擇細胞密集區(qū)域進行圖像采集，發(fā)現(xiàn)細胞質呈均一性非特異高信號熒光染色，核區(qū)亦出現(xiàn)了類似核仁結構的綠色熒光信號高表達（圖5B）。疊加圖像無特異性Zo-1定位，且出現(xiàn)共定位現(xiàn)象，疊加顏色變成青綠色（圖5C）。

2.6 用95%乙醇固定的SGC-7901細胞間連接蛋白形態(tài)

用95%乙醇固定細胞后進行激光共聚焦掃描顯微鏡采圖，熒光標記效果介于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛之間。可以觀察到較為明顯的Zo-1表達及定位于細胞間緊密連接，但胞質和胞核區(qū)呈現(xiàn)略強的彌漫性非特異熒光信號（圖6B）。

3 討論

激光共聚焦掃描顯微鏡由于激光和熒光的共聚焦成像以及針孔應用，阻止了焦點以外的干擾衍射光和散射光。常用的避免或排除光譜交叉干擾方法有很多種，如同時使用幾種熒光探針、降低標記熒光強度以及采用序列掃描等方法。本實驗通過使用不同波長激光依次激發(fā)樣品，同時在相應的熒光檢測通道輪流采集并顯示每種熒光的共聚焦的序列掃描方式，避免了熒光竄色現(xiàn)象的發(fā)生。而為了觀察細胞內部微細結構，確保抗體與其對應抗原自由結合，細胞首先必須固定和打孔。免疫熒光方法中固定的目的是迅速終止酶的活性，避免組織細胞結構的解體，將抗原穩(wěn)定固定在原位，并保持其抗原性。良好的固定劑應能保持細胞及亞細胞結構的真實性，并使抗體大分子進入細胞內與抗原結合［6］。一般分子生物學實驗室常用的固定劑分為兩大類：有機溶劑和交聯(lián)劑［7］。有機溶劑如乙醇和丙酮等可去除類脂并使細胞脫水，同時將細胞結構蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團形成分子間橋連，從而產生一種抗原相互連接的網絡結構。

目前，尚無一種標準固定劑適用于各種抗原的固定，本實驗所采用的3種固定劑在功能上各有優(yōu)缺點。多聚甲醛通過交聯(lián)作用更易于保持細胞的結構，但同時也可能降低一些細胞組分的抗原性，細胞胞膜相關組分、細胞器及細胞顆粒內的抗原一般以多聚甲醛固定。相關研究提示，用4%多聚甲醛固定細胞對抗原有很好的保護作用，但Zo-1信號表現(xiàn)得比較模糊，不及用甲醇固定的細胞表達得銳利結實［8］，可能與其對組織穿透力強、保存抗原的免疫活性較好有關。而有文獻報道，使用甲醇固定轉染綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的細胞會導致GFP的熒光消失，而使用4%多聚甲醛固定時GFP的熒光就沒有失去［9］，這也提示我們要針對不同的觀察對象選擇適合的固定劑。戊二醛可通過固定核蛋白來固定組織和細胞中的DNA和RNA，能保存糖原，但不能避免其他環(huán)節(jié)造成的脂類抽提，因而對細胞膜的固定效果不理想。而乙醇除有機溶劑固定的優(yōu)點之外，也有不足之處：可溶解脂類物質；對組織收縮較大，不宜作單純固定液；滲透力不強；可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白等。通過掃描結果分析，對于細胞骨架的固定可選擇單純的4%多聚甲醛或者添加一些高效去污力的穩(wěn)定劑（針對多聚甲醛易因為交聯(lián)作用而造成的雜質污染）。對于細胞間連接等胞膜蛋白，可選擇4%多聚甲醛或甲醇進行固定。通過細致的比較、合理的使用固定劑，對于樣本制備以及后期掃描觀察結果起到至關重要作用，為后續(xù)深入研究打下實驗基礎。

［1］Rubiolo JA，López-Alonso H，Vega FV.Comparative study of toxicological and cell cycle effects of okadaic acid and dinophysistoxin-2 in primary rat hepatocytes［J］.Life Sci，2012，90（11-12）：416-423.

［2］Boucher I，Yu W，Beaudry S.Gα12 activation in podocytes leads to cumulative changes in glomerular collagen expression，proteinuria and glomerulosclerosis［J］.Lab Invest，2012，92（5）：662-675.

［3］Jung SR，Seo JB，Shim D.Actin cytoskeleton controls movement of intracellular organelles in pancreatic duct epithelial cells［J］.Cell Calcium，2012，51（6）：459-469.

［4］Mahmut Y，Gerhard C.EMT，the cytoskeleton，and cancer cell invasion［J］.Cancer Metastasis Rev，2009，28（1-2）：15-33.

［5］David S，Andreas J.Inhibition of actin dynamics during epithelial-tomesenchymal transition［J］.Biochem Bioph Res Co，2012，419（2）：221-225.

［6］DiDonato D，Brasaemle DL.Fixation methods for the study of Lipid dropIets by immunofIuorescence microscopy ［J］.J Histochem Cytochem，2003，51（）：773-780.

［7］ Schmiedeberg L，Skene P，Deaton A.A temporal threshold for formaldehyde crosslinking and fixation［J］.PLoS ONE，2009，4（2）：e4636-e4638.

［8］范瑾瑾，駱寧，董秀清.不同固定劑在激光共聚焦熒光技術中的效果評價［J］.中山大學學報（醫(yī)學科學版），2009，30（5）：600-604，619.

［9］李榮芳，袁慧，劉定干.甲醇固定導致綠色熒光蛋白的熒光消失［J］.細胞生物學雜志，2007，29（2）：303-304.