嬰兒雙歧桿菌介導HSV-TK/GCV自殺基因治療系統對大鼠膀胱癌組織細胞凋亡及Fas/FasL表達的影響

喻備，王亞榮，殷祥瑞，唐偉

（重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，重慶 400016）

膀胱癌是嚴重威脅人類健康的疾病，是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤之一。手術、化療及放療后患者復發率高，生存率不理想。腫瘤的基因治療是國內外研究的熱點，單純皰疹病毒胸苷激酶基因（herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK）/丙氧鳥苷（ganciclovir，GCV）是目前研究最早最徹底的，廣泛用于腫瘤基因治療的自殺基因系統，而尋找腫瘤特異的靶向基因治療載體是腫瘤基因治療成功的關鍵技術，也是腫瘤基因治療的難點。國內外研究已證實［1～3］，雙歧桿菌對腫瘤組織的厭氧壞死區有特異的靶向性，同時對人體具有較高的安全性，是一種良好的腫瘤基因治療靶向載體。作者前期研究曾利用嬰兒雙歧桿菌（bifidobacterium infantis，BI）介導pGEX-TK/GCV治療大鼠膀胱癌，發現其療效顯著，膀胱腫瘤細胞凋亡明顯增加［4］，但是其機制仍不十分清楚。研究證實［5］，Fas/FasL信號通路介導的細胞凋亡在腫瘤的發生發展過程中扮演了重要角色。本實驗在驗證雙歧桿菌介導pGEX-TK/GCV治療大鼠膀胱癌療效的同時，探討Fas/FasL介導的死亡受體信號通路是否參與了雙歧桿菌介導pGEX-TK/GCV治療系統誘導大鼠膀胱癌細胞凋亡的過程，旨在進一步明確其抑癌作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：嬰兒雙歧桿菌-pGEX-TK菌種、嬰兒雙歧桿菌-pGEX-5X-1菌種由本實驗室保存，N－甲基亞硝基脲（N-Nitroso-N-methylurea，MNU）購自美國Sigma公司，TUNEL試劑盒購于瑞士Roche公司，RT-PCR試劑盒（DRR037S）、DNAMakerDL2000購于TaKaRa公司，兔抗大鼠Fas、FasL多克隆抗體購自Santa Cruz公司（北京中杉生物技術公司分裝），兔抗大鼠GAPDH購于武漢三鷹生物技術有限公司，山羊抗兔二抗、多聚甲醛、PVDF膜購于北京鼎國生物試劑公司，GCV購于宜昌長江藥業有限公司（批號1011001）。PMSF、BCA法蛋白定量試劑盒、SDS-Page凝膠電泳試劑盒和ECL顯影劑均購自碧云天生物技術有限公司。

1.1.2 動物：選用健康成年雌性SD大鼠70只，8～10周齡，體質量180～200 g，飼養環境為重慶醫科大學動物實驗中心無特定病原體（specific pathogen free，SPF）動物房。動物房溫度為（25±2）℃，濕度為（60±5）%，12 h晝夜節律。大鼠可以自由飲水和進食。

1.1.3 儀器：光學顯微鏡、熒光顯微鏡BX51（日本Olympus），低溫高速離心機（長沙湘儀公司），PCR儀、凝膠成像系統（BIO-RAD公司），紫外分光儀（GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠膀胱癌模型的建立及分組：采用MNU膀胱灌注法［6］建立SD大鼠膀胱癌模型，選取荷瘤大鼠54只。將54只荷瘤大鼠隨機分成3組，每組18只，分別為：生理鹽水對照組（生理鹽水組）、BI-pGEX-5X-1組（空質粒組）、BI-pGEX-TK組（重組質粒組）。分別經尾靜脈注射生理鹽水、BI-pGEX-5X-1菌液、BI-pGEX-TK菌液0.5 mL（含重組嬰兒雙歧桿菌約4.4×109個），間隔7 d重復注射1次，共4次。從處理第1天開始，各組大鼠連續28 d腹腔注射GCV（50 mg/kg）。于治療結束后第1天采用斷頸法處死大鼠，解剖膀胱腫瘤，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、HE染色。

1.2.2 各組荷瘤大鼠膀胱質量測定：于治療結束后采用斷頸法處死大鼠，沿大鼠腹壁中線逐層進入腹腔，仔細分離膀胱，去除膀胱周圍脂肪組織，緊貼膀胱壁離斷輸尿管，向下解剖暴露膀胱頸部至前列腺，于前列腺上緣離斷膀胱?？v行解剖膀胱，觀察膀胱內腫瘤生長情況，然后用濾紙吸干液體，稱取各組荷瘤大鼠膀胱的質量。

1.2.3 TUNEL法原位檢測膀胱腫瘤細胞的凋亡及半定量分析：實驗步驟按TUNEL試劑盒說明書操作。在熒光顯微鏡下觀察拍照后，加HRP標記的抗熒光素抗體，DAB顯色，普通光學顯微鏡觀察。細胞核固縮、染色質凝集成塊、呈棕褐色染色者為凋亡細胞。每張切片計數5個視野，每個視野計數100個細胞，凋亡指數計算（apoptotic index，AI），AI=凋亡細胞數/細胞總數。

1.2.4 半定量RT-PCR檢測Fas、FasLmRNA水平：取50 mg大鼠膀胱腫瘤組織用眼科剪剪碎，放入滅酶的勻漿器中，加入1 mL TRIzol提取各組膀胱腫瘤總RNA，紫外分光光度計定量，各取2 μg總RNA為模板逆轉錄為cDNA，用1 μL cDNA為模板分例進行PCR擴增。根據大鼠Fas/FasLcDNA序列由上海生工設計并合成RT-PCR引物，見表1。PCR擴增體系體積為25 μL，反應條件：預變性95℃5 min，變性 95 ℃ 30 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，30個循環，72℃延伸10 min，4℃終止反應。每例取5 μL RT-PCR產物在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，以GAPDH作為內參照，凝膠成像系統攝像并用Quantity One軟件測定各條帶與GAPDH的積分光密度（integrated optical density，IOD）值，其比值為各目的基因的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.5 Western blot檢測大鼠膀胱腫瘤Fas/FasL蛋白表達：將100 mg大鼠膀胱腫瘤用眼科剪剪碎為小塊，放入勻漿器中，加入990 μL RIPA及10 μL 10 mg/mL PMSF溶液，用力研磨成均勻一致的懸液，收集懸液，12 000 r/min，4℃離心15 min，吸取上清液至1.5 mL EP管中，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。于總蛋白中加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后在沸水中處理10 min，取總蛋白40 μg上樣，8%SDS-PAGE電泳，切膠，半干電轉膜儀電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1.5 h，然后分別加入兔抗大鼠GAPDH、Fas、FasL一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，10 min/次。加入HRP標記的山羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，TBST漂洗3次，10 min/次。ECL顯色，凝膠成像系統攝像并測定各目的條帶與GAPDH條帶的灰度值，目的條帶/GAPDH條帶比值為各目的蛋白的相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-PCR

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠膀胱癌建模及病理結果

大鼠膀胱癌建模過程中死亡11只，其中2只在膀胱灌注第8周死亡，解剖發現膀胱內有新生物，病理證實為膀胱移行細胞癌。選取的54只荷瘤大鼠在治療過程中無死亡，其中有8只出現肉眼血尿，2只出現明顯膿尿。

生理鹽水組及空質粒組肉眼觀察及HE染色結果可見大鼠膀胱壁增厚，其表面可見米粒樣、菜花樣新生物，基底寬，有的表面有潰瘍伴出血性壞死。細胞異形性明顯，表現為細胞大小不一，排列紊亂，極性消失；核畸形，核染色質呈粗顆粒狀，常堆積于核膜下；核膜增厚，核仁肥大，核質比例大，核分裂像明顯，部分表現為癌細胞高度未分化，移行上皮結構特征消失，呈彌漫分布或排列成實體性癌，多乳頭粗短融合，伴局灶性黏膜下、肌層浸潤（圖1A、1B）。重組質粒嬰兒雙歧桿菌組：相對于生理鹽水組，腫瘤體積變小，部分出現腫瘤細胞壞死，腫瘤細胞形態變化不大，間質有炎細胞侵潤（圖1C）。各組其他臟器均未見異常。

2.2 各組荷瘤大鼠膀胱質量比較

與生理鹽水組及空質粒組比較，重組質粒組荷瘤大鼠膀胱質量明顯降低（P<0.05）?？召|粒組與生理鹽水組比較，荷瘤大鼠膀胱癌的質量無統計學差異（P>0.05）。表明雙歧桿菌介導HSV-TK/GCV能明顯抑制荷瘤大鼠膀胱癌生長。見表2。

表2 各組荷瘤大鼠膀胱質量及AI值（±s）Tab.2 The bladder weights and apoptotic index in rat bladder tumor model（±s）

表2 各組荷瘤大鼠膀胱質量及AI值（±s）Tab.2 The bladder weights and apoptotic index in rat bladder tumor model（±s）

1）P<0.05，2）P<0.01 vs normal saline group；3）P<0.05，4）P<0.01 vs empty plasmid group.

GroupnBladder weight（mg）AI（%）Normal saline 18 320.17±17.39 8.4±3.15 Empty plasmid 18 310.78±12.31 10.36±3.51 Recombinant plasmid 18 265.22±14.431），3） 27.18±8.652），4）

2.3 大鼠膀胱腫瘤組織中凋亡細胞分布及變化

TUNEL法原位檢測發現各組荷瘤大鼠膀胱腫瘤組織均出現不同程度的凋亡細胞（圖2），以重組質粒組最多。與生理鹽水組及空質粒組比較，重組質粒組AI值顯著增高（P<0.01）；空質粒組與生理鹽水組AI值比較無統計學差異（P>0.05），見表2。

2.4 大鼠膀胱腫瘤組織Fas/FasLmRNA表達

RT-PCR結果顯示，與空質粒組及生理鹽水組比較，重組質粒組Fas/FasLmRNA水平顯著增高（P<0.05），空質粒組與生理鹽水組比較，Fas/FasLmRNA水平無統計學差異（P>0.05）。見圖3。

2.5 大鼠膀胱腫瘤組織Fas/FasL蛋白表達

Western blot結果顯示，重組質粒組Fas/FasL蛋白表達水平明顯高于空質粒組及生理鹽水組（P<0.01），空質粒組和生理鹽水組比較，Fas/FasL蛋白表達無統計學差異（P>0.05）。見圖4。

3 討論

HSV-TK/GCV是目前廣泛用于腫瘤基因治療研究的自殺基因系統之一，其產生自殺作用的確切效果已被許多研究所證實［7］，并已經開始進行臨床試驗［8］。尋找一種安全、高效、特異的靶向性載體成為其推廣應用的關鍵。Li等［9］研究證實嬰兒雙歧桿菌介導可溶性VEGF受體能抑制小鼠肺癌生長，Yazawa等［10］研究證實人工誘導乳腺瘤的大鼠經尾靜脈注射人源雙歧桿菌后能特異性地在瘤內增殖，并引起腫瘤組織萎縮，延長荷瘤鼠的生存期。這些研究均表明，雙歧桿菌作為載體治療實體腫瘤是可行的。本實驗發現，重組質粒組處理荷瘤大鼠膀胱癌，大鼠膀胱質量顯著降低，對實驗大鼠心、肝、腎和腦組織切片觀察，未發現明顯異常。結果表明，雙歧桿菌介導pGEX-TK/GCV治療系統治療荷瘤大鼠膀胱癌是安全、有效的。

HSV-TK/GCV治療腫瘤的機制也已經有了比較廣泛和深入的研究。目前認為，其主要機制為：一是自殺效應，另一個是旁觀者效應，它們可能部分通過誘導腫瘤細胞凋亡產生效應［11～13］。葉剛等［14］利用逆轉錄病毒攜帶HSV-TK基因膀胱灌注治療大鼠膀胱腫瘤，發現大鼠膀胱癌體積有所縮小，腫瘤細胞發生明顯凋亡。作者利用雙歧桿菌作為載體，成功構建了嬰兒雙歧桿菌介導pGEX-TK/GCV治療系統，并初步證實了其治療荷瘤大鼠膀胱癌的療效，同時發現嬰兒雙歧桿菌介導pGEX-TK/GCV處理后，大鼠膀胱癌組織細胞凋亡明顯增加，caspase 3表達也顯著增高［4］。本實驗中，重組質粒組荷瘤大鼠膀胱癌組織細胞凋亡顯著增加，而空質粒組與生理鹽水組比較無統計學差異，表明嬰兒雙歧桿菌介導pGEX-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌，其主要機制可能是通過誘導膀胱癌組織細胞凋亡實現的。

細胞凋亡是由死亡信號誘發的受調節的細胞死亡過程，因此誘導腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的一種有效途徑。細胞凋亡的信號通路主要有兩條：一是細胞外信號激活胞內凋亡酶而誘發凋亡，即死亡受體信號通路；另一條是通過細胞內線粒體釋放凋亡酶激活因子激活凋亡酶而發生凋亡。研究證實［5，15］，Fas/FasL是死亡受體信號通路誘導凋亡的一個重要途徑。Fas是一種屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員的膜蛋白，在細胞凋亡過程中起著重要的作用，與其配體FasL結合后，激活下游效應蛋白caspase 3誘導表達Fas蛋白的細胞發生凋亡。研究證實［16，17］，膀胱腫瘤細胞的凋亡與Fas/FasL死亡受體信號通路密切相關。本實驗中，重組質粒組大鼠膀胱腫瘤細胞凋亡明顯增加，Fas/FasLmRNA及蛋白表達均顯著增高，說明Fas/FasL死亡受體信號通路可能參與了嬰兒雙歧桿菌介導pGEX-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌所誘導的凋亡。此外，除了本實驗所證實Fas/FasL死亡受體信號通路表達變化對嬰兒雙歧桿菌介導pGEX-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌誘導凋亡有影響外，其他誘導凋亡的途徑（如胞內線粒體控制的凋亡途徑）在嬰兒雙歧桿菌介導pGEX-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌誘導凋亡所起的作用還有待進一步研究。本實驗結果結合前期所證實caspase 3蛋白表達上調［4］提示，激活Fas/FasL死亡受體信號通路，引起下游caspase 3蛋白表達上調，從而誘導膀胱腫瘤細胞凋亡可能是嬰兒雙歧桿菌介導pGEXTK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌發揮抑癌作用的機制之一。

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