缺血后處理對糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保護作用

鄒國良，仲維莉，劉莉，胡健

（1.中國醫科大學附屬第一醫院心內科，沈陽 110001；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院心內科，哈爾濱 150040）

再灌注策略能夠挽救急性心肌梗死時瀕臨壞死的心肌，但再灌注后可引起心肌損傷加重，發生缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/RI）［1］。缺血后處理（ischemic postconditioning，IPostC），即心肌缺血后，在長時間的灌注之前，進行1次或數次短暫重復的心肌缺血再灌注，能提高心肌對之前發生的較長時間缺血的耐受性［2］，在抗心肌細胞凋亡、減少心肌梗死面積、保護內皮功能等方面發揮保護作用［3～8］。然而，IPostC對于糖尿病I/RI性心肌是否具有同樣的保護作用及其發生機制仍有待探討。本研究應用糖尿病大鼠模型，結扎大鼠冠狀動脈左前降支（left anterior desscending coronary artery，LAD）模擬在體心肌缺血再灌注，通過觀察心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數（apoptotic index，AI）的變化，評價IPostC對糖尿病大鼠心肌I/RI的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康12周齡雄性SD大鼠48只，購于哈爾濱醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑：氯化三苯基四氮唑、臺盼藍（武漢博士德公司），TUNEL凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物制劑有限公司），CK-MB試劑盒、鏈脲佐菌素（北京博奧森生物制劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備：經尾靜脈注射2%鏈脲佐菌素溶液（45 mg/kg），24 h內給予不限制飲用10%葡萄糖溶液，72 h后采尾血測血糖，連續測3 d，若血糖持續≥16.7 mmol/L，則視為造模成功。糖尿病大鼠適應性飼養1周后進行下一步實驗。

1.2.2 動物分組及處理：隨機將大鼠分為：（1）正常組：正常大鼠自由飼食水，不做任何手術處理；（2）假手術（sham）組：糖尿病大鼠開胸后在LAD下穿線，不結扎；（3）缺血再灌注（IR）組：糖尿病大鼠結扎LAD 造成缺血 30 min，再灌注 2 h；（4）缺血后處理（IPostC）組：糖尿病大鼠結扎LAD 30 min，再灌注30 s，阻斷 30 s，重復 3 次，再灌注 2 h。

1.2.3 肌酸激酶同工酶（creatine kinase workers MB，CK-MB）的測定：實驗結束時由頸動脈采血，室溫靜置 10 min，10 000 r/min 離心 15 min，取上清，-20 ℃凍存。采用全自動生化分析儀測定血清中的CKMB。

1.2.4 心肌梗死范圍測定：經頸動脈采血后，IR組、IPostC組每組隨機選取6只大鼠，原位結扎LAD，從右頸動脈注入1%臺盼藍3 mL/kg，使之灌注藍染非缺血區心肌。隨即取下整個心臟，以PBS沖洗，剪去心房，置-20℃冷凍20 min后，沿心臟長軸等分為4～5份，切片；置于1%TTC溶液中37℃孵育30 min，缺血的心肌組織被染成磚紅色，梗死心肌呈灰白色。通過Optimax圖像處理軟件進行分析，并計算梗死面積（infarct size，IS）與缺血區面積（area at risk，AAR）的比值（IS/AAR）。

1.2.5 心肌細胞凋亡檢測：應用TUNEL法檢測AI，根據試劑盒說明書操作。采用彩色病理圖文分析系統（OLYPUS BX-6.0顯微照相儀），在光學顯微鏡下，對TUNEL染色切片行顯微攝像及檢測。取陽性染色區域不同的5個視野，由強至弱取圖5幅，檢測心肌細胞凋亡陽性細胞和陰性細胞的個數，以心肌凋亡陽性細胞數占總心肌細胞數的百分比作為心肌AI。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠血清中CK-MB水平的比較

比較缺血前各組大鼠血清CK-MB，無統計學差異（P>0.05）；再灌注2 h后，IR組血清CK-MB明顯升高，與正常組、sham組比較，差異有統計學意義（P<0.01），IPostC組血清CK-MB水平明顯低于IR組，差異有統計學意義（P<0.01）。見表1，圖1。

表1 各組大鼠血清中C K-M B水平的比較（±s，n=1 2）T a b.1 C o m p a r i s o n o f s e r u m C K-M B l e v e l i n e a c h g r o u p（±s，n=1 2）

表1 各組大鼠血清中C K-M B水平的比較（±s，n=1 2）T a b.1 C o m p a r i s o n o f s e r u m C K-M B l e v e l i n e a c h g r o u p（±s，n=1 2）

1）P<0.0 1 v s n o r m a l g r o u p；2）P<0.0 1 v s I R g r o u p.

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2.2 各組大鼠心肌梗死面積的比較

非缺血心肌被染成藍色，缺血心肌被染成磚紅色，梗死心肌呈灰白色。經圖像分析系統計算IS/AAR，結果顯示：IR組可見明顯的梗死心肌，IS/AAR為29.6%±4.3%，與IPostC組（16.9%±2.6%）比較，心肌梗死面積明顯減小，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 各組大鼠心肌細胞AI的比較

TUNEL染色結果（圖3）顯示：凋亡細胞胞核被染成棕黃色，正常組、sham組僅可見少量的凋亡細胞，IR組凋亡細胞明顯增多，計算AI結果顯示：IR組AI（25.1%±4.0%）高于正常組（3.6%±0.6%）和sham組（3.8%±0.4%），差異有統計學意義（P<0.01）。IPostC 組 AI（15.9%±2.9%）明顯低于 IR 組（25.1%±4.0%），差異有統計學意義（P<0.01）。

3 討論

IPostC可減輕心肌I/RI，但其作用機制目前尚不完全清楚。研究證實，在心肌I/RI中，梗死和凋亡是細胞數量減少的原因，它們共同參與了I/RI中心肌細胞的死亡過程。本研究采用梗死面積和AI作為檢測糖尿病大鼠心肌I/RI的指標。采用TTC染色法檢測了大鼠心肌梗死面積，非缺血心肌被染成藍色，缺血心肌被染成磚紅色，梗死心肌呈灰白色。結果顯示：IPostC能減小大鼠心肌梗死面積，降低IS/AAR比值。CK-MB是心肌受損的重要指標，當心肌受損時CK-MB從心肌細胞釋放入血中。本研究結果顯示：IPostC在減小大鼠心肌梗死范圍的同時，能夠降低大鼠血清中CK-MB水平，提示IPostC能夠減輕糖尿病大鼠心肌I/RI的程度。

細胞凋亡是指在一定的生理或病理條件下遵循自身的程序，由基因調控的主動的死亡過程。它是擴大心肌梗死范圍的一個獨立因子，不僅可影響心肌梗死的面積，而且能夠促使心臟重構［9］。心肌凋亡細胞主要位于心肌梗死區周圍。心肌細胞被多種病理性因素（如血管堵塞、缺氧及生物毒性等）刺激后，通過細胞信號傳導系統誘發凋亡程序啟動。細胞凋亡是I/RI的特征性改變，細胞凋亡的發現對I/RI預后的判斷具有重要意義。提示我們可以從細胞凋亡角度對缺血再灌注后心功能的恢復及心肌保護進行研究［9，10］。本研究采用TUNEL法進行心肌細胞凋亡檢測，凋亡細胞胞核被染成棕黃色。結果顯示：IPostC可明顯抑制I/RI引起的心肌細胞凋亡，降低I/RI的程度，從而起到保護心肌的作用。

本課題組已證實IPostC可通過激活PI3K/AKT信號通路，調控Bcl-2、Bax蛋白的活化，從而發揮對糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保護作用，但PI3K/AKT信號通路激活下游后如何發揮心肌保護作用還有待進一步研究［11］。

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［2］Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physio1，2003，285（2）：H579-H588.

［3］Yang XM，Philipp S，Downey JM，et al.Postconditioning′s protection is not dependent on circulation blood factors or cells but involves adenosine receptors and requires PI3-kinase and guanylate cyclase activation［J］.Basic Res Cardiol，2005，100（1）：57-63.

［4］Song WY，Dong HL，Cheng Q，et al.Ischemic postconditioning induces neuroprotectionvia up-regulationof endogenous antioxidant en－zyme activities：experiment with rabbits ［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88（33）：2355-2359.

［5］Zhang YM，Wang Y，Liu XH，et al.Cardioprotective effect of edaravone pharmacological postconditioning on acute myocardial ischemia/reperfusion injury：experiment with rat［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88（36）：2558-2561.

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［7］孫凱，劉志蘇，孫權.缺血后處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用［J］.南方醫科大學學報，2009，29（12）：2480-2484.

［8］朱偉偉，王鵬程，李小松.IL-17在缺血再灌注損傷中作用的研究進展［J］.首都醫科大學學報，2011，32（2）：304-307.

［9］Gross ER，Gross GJ.Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning［J］.Cardiovasc Res，2006，70（2）：212-221.

［10］PaillardM，GomezL，Augeul L，et al.Postconditioning inhibits mPTP opening independent of oxidative phosphorylation and membrane potential［J］.J Mol Cell Cardiol，2009，46（6）：902-909.

［11］鄒國良，仲維莉，胡健.缺血后處理對糖尿病大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響［J］.中國醫科大學學報，2009，38（10）：745-748.