SFRP5在白血病細(xì)胞中基因甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)分析

王慧涵，張國君，姚鯤，楊威，廖愛軍，趙成海，劉卓剛

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院血液科，沈陽 110004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽 110001）

分泌型卷曲相關(guān)蛋白5（secreted frizzled related protein 5，SFRP5）是分泌型糖蛋白家族成員之一，基因定位在10q24.1。SFRP5結(jié)構(gòu)上與Wnt信號通路特異性受體卷曲蛋白（Fz）受體極為相似，具有同源的配體抑制區(qū)，但缺少7個編碼跨膜部分的結(jié)構(gòu)域，因此SFRP5能夠通過競爭性抑制Fz受體來抑制Wnt的活動［1］。有研究顯示在多種腫瘤細(xì)胞中SFRP5基因啟動子區(qū)域存在甲基化，導(dǎo)致基因沉默后對Wnt信號通路的抑制作用減弱，從而促進(jìn)腫瘤的形成與發(fā)展［2］。在本研究中，我們對白血病患者標(biāo)本及白血病細(xì)胞系中SFRP5基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本：2011年6月至2011年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液科初次診斷的12例急性白血病患者（L1-L12，根據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)）骨髓單個核細(xì)胞作為實驗標(biāo)本。12例患者的疾病類型為：L1：急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）；L2：慢性粒細(xì)胞白血病（chronic granulocytic leukemia，CGL）；L3：急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）-M4；L4：AML-M2；L5：CGL；L6：AMLM4；L7：CGL；L8：AML-M2；L9：ALL；L10：AML-M4Eo；L11：AML-M5；L12：AML-M6。采用同期正常人 6 例（N1-N6）作為對照。人白血病細(xì)胞系HL-60由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液科楊瑩惠贈；人白血病細(xì)胞系KG1a來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所；人淋巴瘤白血病細(xì)胞系Raji、人白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞由上海復(fù)旦大學(xué)賈立軍教授惠贈。

1.1.2 試劑：Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自沈陽寶泰克生物公司。AxyPrep基因組DNA小量試劑盒、MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit、Platinum-DNAPolymerase及AxyPrep凝膠回收試劑盒均購自美國Invitrogen公司。ZymoTagTMDNA Polymerase及EZ DNA Methylation-Gold Kit購自Zymo Research公司。BCA法蛋白濃度測定試劑盒及超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。兔抗人SFRP5購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 甲基化特異性PCR（MSP）檢測基因甲基化：用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取基因組DNA。用MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit試劑盒對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理。以處理后的DNA為模板，MSP檢測SFRP5基因甲基化。引物序列：甲基化上游引物：5′-TGGCGTTGGGCGGGACGT TC-3′，甲基化下游引物 5′-AACCCGAACCTCGCCG TACG-3′，非甲基化上游引物 5′-TGGTGTTGGGTGG GATGTTTG-3′，非甲基化下游引物 5′-CAACCCAAA CCTCACCATACAC-3′。PCR 擴增體系 20 μL：修飾后的 DNA 20 ng，10 μmol/L 上下游引物各 0.4 μL，Reaction Buffer 10 μL，dNTP Mix 0.2 μL，ZymoTagTMDNA Polymerase（5 U/μL）0.16 μL，滅菌 ddH2O 加至總體積20 μL。PCR擴增條件：95℃10 min；94℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40 個循環(huán)；72 ℃10 min。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.2.2 亞硫酸鹽測序法（BSP）檢測基因甲基化：提取基因組DNA及對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理與MSP方法所述部分相同。對KG1a細(xì)胞中SFRP5基因－394 bp到+99 bp位點的CpG甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析。檢測長度494 bp，共設(shè)計兩對引物對P1、P2片段進(jìn)行甲基化檢測。引物序列：P1上游引物 5′-AGTTTTTTATTAGGGAGAAGAGGA-3′，P1 下游引物 5′-CAAATCTTACRCCCCTCT-3′，P2 上游引物 5′-GAGGTTAGGGTTGYGGTA-3′，P2 下游引物5′-ATAACTACRCCCTCTCCAAATA-3′。PCR 擴增體系 50 μL：10×PCR Buffer 5 μL，Mg2+1.5 μL，dNTP 1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，Platinum Taq 0.3 μL，DNA 2 μL，ddH2O 38.2 μL。PCR 擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共 40個循環(huán)；72℃5 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。用Axygen凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T Vector，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取平板上的單克隆，培養(yǎng)，克隆測序。

1.2.3 Western blot檢測SFRP5蛋白表達(dá)：收集細(xì)胞，PBS洗2遍，每107個細(xì)胞加1 mL預(yù)冷的RIPA裂解液，混勻，冰上震蕩 30 min，4℃，12 000 r/min離心30 min，收上清，BCA方法測蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，用SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。將硝酸纖維素濾膜加入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，4℃搖床孵育過夜，加入兔抗人非磷酸化βcatenin，兔抗人SFRP5及兔抗人P-gp一抗，4℃搖床孵育過夜。除去一抗，加入鼠抗兔二抗，室溫下?lián)u床孵育2 h，除去二抗。加顯色劑，在X線膠片曝光成像并分析。

2 結(jié)果

2.1 SFRP5基因在白血病患者中的甲基化狀態(tài)

MSP方法對12例患者（L1-L12）SFRP5基因甲基化狀態(tài)檢測結(jié)果顯示，7例（58.3%）患者（L2、L4、L5、L6、L7、L8、L11）發(fā)生了 SFRP5 基因甲基化，其中L5和L6發(fā)生了部分SFRP5基因甲基化。6例正常人（N1-N6）標(biāo)本均未發(fā)生SFRP5基因甲基化（圖1）。

2.2 SFRP5蛋白在白血病患者標(biāo)本中的表達(dá)

結(jié)果顯示，6例正常標(biāo)本均存在SFRP5蛋白表達(dá)。而在白血病患者標(biāo)本中有7例發(fā)現(xiàn)SFRP5表達(dá)，其余5例未檢出SFRP5蛋白表達(dá)（L2、L4、L7、L8、L11），見圖2。5例未探測到SFRP5蛋白表達(dá)的患者標(biāo)本均發(fā)生了該基因的完全甲基化，而另外2例SFRP5基因發(fā)生部分甲基化的標(biāo)本（L5、L6），SFRP5蛋白表達(dá)低于正常水平。

2.3 SFRP5在白血病細(xì)胞系中的表達(dá)及甲基化狀態(tài)分析

MSP方法對白血病細(xì)胞系HL-60、Raji、U937和KG1a中SFRP5基因甲基化狀態(tài)檢測結(jié)果顯示，所有細(xì)胞系均發(fā)生SFRP5基因甲基化（圖3A）。

Western blot檢測結(jié)果顯示上述細(xì)胞系中均未檢測到SFRP5蛋白表達(dá)（圖3B）。使用去甲基化試劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷酸（DAC）處理上述細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)處理后4種細(xì)胞系中均出現(xiàn)SFRP5表達(dá)（圖3B）。

2.4 BSP方法對KG1a細(xì)胞中SFRP5基因甲基化狀態(tài)分析

對KG1a細(xì)胞中SFRP5基因啟動子區(qū)－394 bp到+99 bp位點的CpG甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，檢測長度共494 bp，共設(shè)計兩對引物，分兩部分對該片段進(jìn)行分析，結(jié)果顯示P1片段長度為224 bp，存在10個CpGs，總甲基化頻率為85.0%（圖4A）。P2片段長度為270 bp，存在32個CpGs，總甲基化頻率為80.0%（圖4B）。證實KG1a細(xì)胞中SFRP5基因存在高度甲基化狀態(tài)。

3 討論

基因突變在人類腫瘤中比較常見，其常通過激活癌基因或沉默抑癌基因而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。除了基因突變以外，表觀遺傳改變例如異常DNA甲基化，是導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的另一種重要途徑［3］。DNA甲基化并不引起核苷酸序列的改變，但是能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)某些基因啟動子區(qū)甲基化及其所導(dǎo)致的基因沉默在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［4，5］。近年來關(guān)于SFRP基因在腫瘤細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)及其作用得到了越來越多的關(guān)注。

SFRP是一種分泌型糖蛋白家族，由SFRP基因編碼。目前研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物SFRP家族主要包括SFRP1-5。SFRP5是SFRP家族的一個分泌型蛋白，基因定位在10q24.1。目前對SFRP5的研究主要集中在3個方面：（1）SFRP5在胚胎發(fā)育早期細(xì)胞極性及器官形成中的作用。Li等［6］研究非洲爪蟾蜍胚胎形成過程發(fā)現(xiàn)，SFRP5抑制wnt11，通過經(jīng)典Wnt/β-catenin及非經(jīng)典Wnt/PCP信號通路調(diào)節(jié)非洲爪蟾蜍前腸形成過程中的細(xì)胞命運及形態(tài)形成。Satoh等［7］證明SFRP5在鼠早期軀干形成過程中起重要作用；（2）SFRP5參與肥胖的調(diào)節(jié)。Schulte等［8］研究發(fā)現(xiàn)小鼠健康的脂肪細(xì)胞能夠分泌抗炎性分子SFRP5，抑制巨噬細(xì)胞分泌的促炎性分子wnt5a的作用。Ouchi等［9］也通過研究指出SFRP5-JNK1調(diào)節(jié)通路是控制肥胖相關(guān)血糖異常的可能潛在靶點；（3）SFRP5基因甲基化參與腫瘤形成與發(fā)展。Kazumori等［10］檢測了 4種人腎癌細(xì)胞系（Caki1、Caki2、ACHN及A498），發(fā)現(xiàn)存在SFRP5表達(dá)下降，并與SFRP5基因甲基化有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SFRP5蛋白能夠誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡，認(rèn)為SFRP5基因可能是一種抑癌基因。Lin等［11］對子宮頸腺癌研究顯示SFRP5基因甲基化頻率為 73.9%（17/23），恢復(fù)SFRP5的表達(dá)能夠抑制子宮頸癌克隆形成及侵襲。Ho等［12］對卵巢癌的研究顯示伴有SFRP5啟動子區(qū)甲基化的患者5年總生存期要差于未甲基化者（0.52∶0.88，P=0.03）。SFRP5啟動子區(qū)甲基化可能成為卵巢癌預(yù)后評估指標(biāo)及治療靶點。Veeck等［13］在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)73%存在SFRP5啟動子區(qū)甲基化，SFRP5啟動子區(qū)甲基化與總生存期減少有關(guān)。

目前報道SFRP5基因甲基化在白血病中的作用及機制文獻(xiàn)很少。我們應(yīng)用MSP及BSP方法對12例白血病患者標(biāo)本、4種白血病細(xì)胞系及6例正常對照標(biāo)本進(jìn)行了SFRP5基因甲基化檢測，結(jié)果顯示在12例患者標(biāo)本中有7例（58.3%）發(fā)生了SFRP5基因甲基化，而6例正常標(biāo)本均未發(fā)生SFRP5基因甲基化。白血病細(xì)胞系HL-60、Raji、U937和KG1a中SFRP5基因均呈甲基化狀態(tài)。對蛋白水平的檢測顯示，發(fā)生SFRP5基因甲基化的標(biāo)本均出現(xiàn)蛋白表達(dá)缺失或下調(diào)。

本實驗結(jié)果初步證實了白血病細(xì)胞中存在SFRP5基因甲基化，并可導(dǎo)致SFRP5蛋白表達(dá)缺失或下調(diào)，但這種改變在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用尚待進(jìn)一步研究，并需擴大樣本量，探討SFRP5基因在不同類型白血病中的甲基化頻率。

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