不同光照方式介導(dǎo)的光動力療法對牛牙糞腸球菌根管感染模型的體外抗菌效應(yīng)

王燕煌，郭曉霞，黃曉晶，江山

（福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓教研室，福建省高校口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，福州350002）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.faecalis）是目前公認的引起根管治療失敗的主要致病菌［1］，有效清除根管內(nèi)E.faecalis感染是現(xiàn)階段牙體牙髓治療的研究重點之一。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）作為一門新技術(shù)目前已逐漸進入口腔科研工作者的視野。PDT由三要素組成，包括光源、光敏劑和氧，三者缺一不可。良好的光源是PDT不可缺少的條件，光源的存在使得光動力反應(yīng)得以順利進行。現(xiàn)階段PDT的研究重點主要集中在新型光敏劑的研發(fā)，有關(guān)光源的文獻報道相對較少，且主要集中在光照劑量及功率密度等方面［2］，這可能是由于以往對光照發(fā)射方式的重要性認識不足。實際上，PDT療效除取決于光敏劑給藥劑量和光照劑量外，還取決于對光照方式的把握。光導(dǎo)纖維作為激光傳播介質(zhì)，在光動力反應(yīng)中的重要性不可忽略。目前有關(guān)PDT根管消毒時光照方式的研究主要包括兩方面：將光導(dǎo)纖維置于根管內(nèi)照射或根管口照射［3］，其中前者研究相對較多。考慮到根管內(nèi)照射存在一定局限性，如增加實驗操作的繁冗性以及由于需要特別定制符合根管內(nèi)徑的光導(dǎo)纖維而增加實驗成本，故有必要尋求一種簡便、有效且能將其應(yīng)用于根管復(fù)雜環(huán)境中的光照方式。本實驗擬通過體外建立牛牙E.faecalis根管感染模型，比較不同光照方式對PDT抗菌效應(yīng)的影響，旨在探討光照方式在光動力反應(yīng)中的重要性，為今后研究PDT對根管E.fae－calis感染的抗菌效應(yīng)奠定技術(shù)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細菌：E.faecalis國際標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC33186），美國菌種保藏中心提供。

1.1.2 實驗樣本：小牛恒切牙。

1.1.3 光敏劑：亞甲基藍（methylene blue，MB），購自美國Sigama Aldrich公司，光敏劑避光保存與操作。

1.1.4 主要試劑及材料：2.5%次氯酸鈉溶液，購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；17%EDTA溶液，購自江西凱隆化工有限公司；PBS，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；吸潮紙尖40#，購自北京達雅鼎醫(yī)療器械有限公司；無菌消毒包，將實驗用鋪巾、托盤、眼科專用鑷、吸潮紙尖等物品打包，121℃、1.5 MPa、15 min高溫高壓滅菌。

1.1.5 主要儀器與設(shè)備：SAS-DL3醫(yī)用激光治療儀，購自北京壽安山責(zé)任有限公司；平端面光纖，工作端直徑1 mm，用于根管口照射，購自南京春暉科技實業(yè)有限公司；柱狀光纖，工作端直徑400 μm，長度10 mm，用于根管內(nèi)照射，購自南京飛帝斯光纖機械電子工程制作中心；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；全自動酶聯(lián)免疫測定儀，購自德國Human公司；冷凍高速離心機，購自德國Heraeus公司；XL-30掃描電鏡，購自荷蘭飛利浦公司。

1.2 方法

1.2.1 光敏劑配制：取149.6 mg MB粉末溶于20 mL PBS中，光敏劑終濃度為100 μmol/L。制備完成后，用孔徑0.22 μm的過濾膜過濾除菌，置于4℃冰箱避光保存。

1.2.2 建立牛牙E.faecalis根管感染模型

1.2.2.1 實驗樣本選擇與制作 收集新鮮拔除的完整小牛恒切牙30顆，要求牙根無裂痕、無齲壞、根尖孔發(fā)育完全。去除牙根周圍的牙結(jié)石和牙周膜后，將樣本放入生理鹽水中4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂醚揽聘咚偈謾C在流水冷卻下沿釉牙骨質(zhì)界處切除牙冠，保留牙根長度為20 mm，拔除根髓后，以不銹鋼K-file（登士柏公司）按標(biāo)準(zhǔn)法進行根管預(yù)備。根管的工作長度以根管長度減l mm，即約19 mm為標(biāo)準(zhǔn)，根管均預(yù)備至80#。根管預(yù)備過程中每更換大一號銼用2.5%次氯酸鈉溶液5 mL勻速沖洗根管，根管預(yù)備完成后用17%EDTA溶液沖洗根管1 min，以去除玷污層，最后用生理鹽水做最終沖洗，將所有樣本置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩ｋS機抽取6個樣本進行掃描電鏡觀察，確定根管壁玷污層基本去除干凈，牙本質(zhì)小管口開放。

1.2.2.2 實驗樣本消毒滅菌 將制作好的樣本分別放入含10 mL腦心浸液液體培養(yǎng)基的玻璃試管中，于121℃、1.5 MPa、15 min高溫高壓滅菌。然后將裝有樣本及腦心浸液液體培養(yǎng)基的玻璃試管放厭氧箱中培養(yǎng)48 h后取出，肉眼觀察，若腦心浸液液體培養(yǎng)基仍保持透明，則認為滅菌效果可靠。

1.2.2.3 菌株活化 凍存的E.faecalis標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)復(fù)蘇、傳代，厭氧培養(yǎng)（37 ℃，80%N2，10%CO2，10%H2）48 h，經(jīng)染色鏡檢證實為純培養(yǎng)后，挑起3～5個單菌落接種于5 mL液體腦心浸液培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期的細菌混懸液離心（4000 r/min，10 min），棄上清，懸浮菌體于PBS中，調(diào)節(jié)菌液濃度D（630）=1.0，含菌量約為3.5×109CFU/mL。

1.2.2.4 建立E.faecalis根管感染模型 將上述配制好的E.faecalis菌液接種于無菌離體牙根管內(nèi)，隔日更換新鮮培養(yǎng)液，厭氧培養(yǎng)28 d后隨機選取6個樣本進行掃描電鏡檢測，確定E.faecalis根管感染模型成功建立［4］。

1.2.3 實驗分組：將建模成功后的18個牛牙樣本隨機分為2組，每組9個樣本。根管口照射組：實驗根管注入濃度為100 μmol/L的MB（注入量以平齊根管口為準(zhǔn)），光敏劑靜置孵育10 min后將直徑為1 mm的平端面光纖置于根管口照射5 min；根管內(nèi)照射組：實驗根管注入濃度為100 μmol/L的MB（注入量以平齊根管口為準(zhǔn)），光敏劑靜置孵育10 min后將直徑為400 μm、工作長度為10 mm的柱狀光纖置于根管內(nèi)距根尖1 mm的位置，由下往上照射根管5 min。2組實驗所選激光器波長為670 nm，光纖輸出功率經(jīng)過統(tǒng)一校正后，均設(shè)置為50 mW。

1.2.4 細菌計數(shù)：所有牛牙樣本均在實驗前、后取樣，將2根40#無菌紙尖置于根管內(nèi)，停留1 min，取樣液，立即放入裝有l(wèi) mL PBS的Eppendorf管中，小型振蕩器振蕩1 min，用取樣槍吸取Eppendoff管中100 μL液體，10倍比系列稀釋，取100 μL稀釋樣本分別接種于腦心浸液瓊脂平皿上，培養(yǎng)24～48 h后計算菌落形成單位（CFU/mL）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

將細菌計數(shù)結(jié)果按lg（菌落形成單位）做對數(shù)轉(zhuǎn)換，用SPSS17.0軟件包進行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，采用配對t檢驗比較每組根管內(nèi)E.faecalis在實驗前后菌落形成單位的變化，組間差異采用兩樣本t檢驗進行評價。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 牛牙E.faecalis根管感染模型成功建立

厭氧培養(yǎng)第28天，隨機選取6個樣本進行掃描電鏡檢測，實驗觀察到E.faecalis密集浸潤于牙本質(zhì)小管內(nèi)，即E.faecalis根管感染模型成功建立。見圖1。

2.2 不同光照方式介導(dǎo)的PDT對牛牙E.faecalis根管感染的抗菌效應(yīng)

根管口照射組實驗前菌落形成單位為（7.322 7±0.0215），實驗后為（5.9980±0.060 7）；根管內(nèi)照射組實驗前菌落形成單位為（7.3121±0.024 9），實驗后為（5.917 7±0.1023）。經(jīng)PDT處理后，2組根管內(nèi)E.faecalis數(shù)目較實驗前均顯著下降（P＜0.05），但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

E.faecalis在根管內(nèi)的致病機制目前尚未完全明了，如何有效去除根管內(nèi)E.faecalis感染對提高臨床根管治療成功率具有重要意義。以往研究發(fā)現(xiàn)，將光導(dǎo)纖維置于根管內(nèi)照射可以對感染的E.faecalis產(chǎn)生較強光敏效應(yīng)［5］。但該方法增加了操作的繁冗性，且由于根管內(nèi)徑較細小需要特別定制符合根管尺寸的光導(dǎo)纖維，因而增加治療成本。另外，在彎曲根管的應(yīng)用中，由于材料柔韌性能受限，使用不當(dāng)將可能引起光導(dǎo)纖維折斷。因此，尋求一種便捷、有效、具有較低技術(shù)敏感性的光照方法已成為學(xué)者們致力解決的目標(biāo)之一。

現(xiàn)階段隨著技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)療專用輸出光纖頭研制技術(shù)日趨成熟，人類對輸出光纖頭的選擇亦隨之增多。目前，常見的輸出光纖頭有平端面光纖、球形光纖以及柱狀光纖，其選擇主要取決于病變組織的部位及形狀。PDT用于根管消毒時，選取平端面光纖將其置于根管口照射將使操作簡便化，但其抗菌效應(yīng)如何，結(jié)果尚未得知。為此，本實驗擬通過選取平端面光纖和柱狀光纖，觀察比較2種不同光照方式介導(dǎo)的PDT對根管內(nèi)E.faecalis感染是否具有相同抗菌效應(yīng)。另外，為了使實驗具有可比性，本研究中2種不同光導(dǎo)纖維的輸出功率經(jīng)過統(tǒng)一校正后均設(shè)定為50 mW，即激光總能量均為15 J。

實驗結(jié)果顯示：在光照能量統(tǒng)一的情況下，將光導(dǎo)纖維置于根管口照射及根管內(nèi)照射對E.faecalis的抗菌效應(yīng)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），這與Nunes等［3］的研究結(jié)果一致，該實驗中所選的樣本為長度15 mm的單根管離體牙。而本實驗所選的樣本為小牛恒切牙，其根管較直，且所有牙根均較長，統(tǒng)一定長為20 mm。本實驗的結(jié)果提示，對于長度在20 mm以內(nèi)的直根管的治療，PDT抗菌效應(yīng)不受光導(dǎo)纖維在根管內(nèi)位置的影響。而對于臨床常見的彎曲根管、超長根管，選擇根管口照射方式是否亦能達到有效抗菌，未來仍需通過大量實驗得以證實。

盡管實驗結(jié)果顯示，2種光照方式介導(dǎo)的PDT對根管內(nèi)E.faecalis均具有殺傷作用，但仍不能達到完全滅菌的效果，推測這與光敏劑的性能有一定關(guān)聯(lián)。MB作為本實驗所選光敏劑，其很重要的一個物理特性是在水溶液中為聚合狀態(tài)。由于MB在水溶液中容易形成二聚體，而二聚體對MB的光物理特性影響很大，可影響活性氧簇的生成，因而降低光敏效應(yīng)［7］。另外，由于光動力反應(yīng)中起核心作用的活性氧簇其半衰期較短，在水溶液中壽命僅為4 μs，且其作用半徑較短，只有10～20 nm，因此作用范圍有限，僅能破壞鄰近的細胞結(jié)構(gòu)［8］，而以往的研究證實E.faecalis在牙本質(zhì)小管內(nèi)的浸潤深度可深達1000 μm［9］，推測本實驗未能達到完全滅菌可能與PDT作用深度不能到達細菌在牙本質(zhì)小管內(nèi)的感染深度有關(guān)聯(lián)。再則本實驗所選的光照時間為5 min，光照參數(shù)參考以往的文獻［10］，推測與該時間范圍內(nèi)的光照處理尚不能使本實驗條件下的細菌發(fā)揮至最佳敏感狀態(tài)有關(guān)聯(lián)。當(dāng)然，這一推斷還有待于后期的研究證實。

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