高侵襲性膠質瘤細胞轉移相關miRNA的芯片分析

李少一，高蕓，劉宏宇，王國棟，李曉東，馬維寧，劉云會

（中國醫科大學1.附屬盛京醫院神經外科，沈陽110004；2.附屬第一醫院內分泌研究所，沈陽110001）

膠質瘤是人腦最常見的惡性腫瘤，約占40.49%，膠質瘤的特點是侵襲性強且容易復發。微小RNA（microRNA或miRNA）是指長度約21～25 nt的某些特殊的小型非編碼RNA組成的家族，這些miRNA能夠識別特定的目標mRNA，并在轉錄后水平通過促進靶mRNA的降解和（或）抑制翻譯過程而發揮負調控基因表達的作用［1］。近年來，其研究已經從基礎研究迅速上升到臨床研究，研究證實miRNA參與諸多基因激活和失活的調節，逐漸成為腫瘤、心血管、免疫、炎癥等疾病發生發展過程中的重要分子標志［2～4］。miRNA作為腫瘤標志物，對預測人膠質瘤的侵襲轉移和臨床預后的相關研究還需要深入解析。腫瘤侵襲和轉移是主動過程，該過程可以概括為3個步驟：（1）腫瘤細胞與細胞外基質成分黏附；（2）腫瘤細胞釋放或誘導釋放蛋白水解酶，降解細胞外基質；（3）降解區域腫瘤細胞在趨化因子引導下遷移。腫瘤細胞必須啟動并成功地完成所有這些步驟才能進入循環系統和淋巴系統，形成遠隔轉移［5，6］。為了深入研究侵襲轉移步驟的機制，研究者建立了一些體外侵襲模型用于評估不同腫瘤細胞的侵襲活性［7，8］。為了深入了解轉移相關性miRNA表達的改變對人膠質瘤淋巴轉移的影響，我們從人類膠質瘤細胞系T98G中用Transwell侵襲小室技術通過體外篩選，建立了高侵襲性的膠質瘤細胞亞群（命名為T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3）。通過分析其在軟瓊脂中集落形成情況，比較幾種細胞亞群的體外集落形成能力，并采用miRNA芯片技術分析膠質瘤中與轉移密切相關的miRNA表達譜，旨在篩選與膠質瘤侵襲轉移密切相關的miRNA。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人膠質瘤細胞系T98G購自ATCC，細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養液中，放置37℃、5%CO2的細胞培養箱中。

1.2 Transwell體外侵襲實驗篩選高侵襲性的細胞亞群

用Transwell侵襲小室根據T98G細胞的侵襲性差異把他們分成不同細胞亞群。即用一種重新溶解配成原來濃度的基膜凝膠涂鋪Transwell有小插孔的聚碳酸酯膜（含8 μm孔）。將T98G細胞（5×104/孔）接種于Transwell小室上室，高侵襲性細胞消化基質膠后穿過Transwell小室聚碳酸酯膜上8 μm小孔進入小室下室，于37°C放置48 h后，收集高侵襲性細胞群。分別選出3個細胞亞群T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3。那些沒有移行至Transwell小室下室，停留在上室的細胞群，作為對照細胞命名為T98G-4C-1、T98G-4C-2和T98G-4C-3。

1.3 軟瓊脂集落形成實驗

1×103個對數生長期T98G細胞懸浮于含0.3%軟瓊脂的完全培養液中，播種于1%底層軟瓊脂上（100 mm組織培養皿），放置37℃、5%CO2的細胞培養箱中2周后，計數可見集落。

1.4 miRNA芯片分析

用Trizol（Invitrogen公司）提取RNA，委托博奧生物公司進行miRNA芯片分析。采用LuxScan10K激光共聚焦掃描儀掃描雜交芯片，并用LuxScan3.0軟件分析表達譜。采用Partek Genomics Suite分析表達譜結果，P<0.05、Fold Change>2為差異表達miRNA。

2 結果

2.1 T98G細胞亞群的成瘤性比較

利用Transwell小室，根據其侵襲性的差異，將人類的膠質瘤細胞株T98G分為2個不同的細胞亞群。穿過基質膜的細胞作為高侵襲性的細胞亞群（T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3）。而那些留在小室上室的細胞亞群作為對照組（T98G-4C-1、T98G-4C-2和T98G-4C-3）。用體外集落形成實驗來檢測選定的細胞亞群的成瘤性。如圖1所示，在軟瓊脂上的T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3細胞亞群，形成的集落數量分別是對照組的2.7、3.4和3.2倍。

2.2 與人膠質瘤T98G細胞侵襲轉移密切相關的miRNA表達譜

為了解析參與調控膠質瘤侵襲轉移的miRNA，我們分析了高侵襲性細胞亞群與對照組的表達有差異的miRNA。如表1顯示，高侵襲性細胞亞群與對照細胞亞群比較，采用Partek Genomics Suite分析表達譜結果，有11個miRNA的表達有顯著差異（P<0.05，Fold Change>2），其中5個miRNA的表達上調（let-7b、miR-200A、miR-222、miR-106 和 miR-193）和6個miRNA的表達下調（mir-199B、mir-26A、mir-34、miR-29、mir-15A 和 mir-16）。

3 討論

至今我們對腫瘤惡性轉化及侵襲轉移演變過程的了解還很有限，本研究采用Transwell侵襲小室，從人膠質瘤細胞株T98G中篩選出高侵襲及轉移潛能的細胞亞群。結果顯示，Transwell侵襲小室的體外篩選是一個可行的方法，能夠分離不同惡性程度的細胞亞群，這些細胞亞群可用于進一步評估膠質瘤侵襲和轉移相關性的研究。為了鑒別miRNA表達譜有顯著差異，我們通過微點陣分析3個不同的高侵襲性亞群和對照亞群，并獲得了與轉移相關的miRNA差異表達圖譜。本研究所用的所有細胞系均來自同一母細胞系，因此他們有相同的遺傳背景，但有不同轉移潛能。當我們比較侵襲性亞群和對照亞群時，我們鑒別出11個差異性調節miRNA。在高轉移的細胞亞群與對照組間，已確定存在差異表達的11個 miRNA 中，有 9個 miRNA（let-7b、mir-222、mir-106、mir-193、mir-34、mir-29、mir-26a、mir-15a 和mir-200）在腫瘤細胞轉移的進展中及間質上皮的轉變發揮了重要作用［9～12］；而mir-199B和mir-16分別涉及腫瘤干細胞的分化及凋亡［13，14］。

miRNA在不同組織、不同發育階段中的表達水平有顯著差異，miRNA表達模式具有分化的位相性和時序性，而且miRNA作為一種廣泛存在的對基因表達進行微調的分子，通過網絡式調控方式，可以從整體上調控有機體的生命活動。在本研究中我們獲得了關于轉移相關的miRNA差異表達的相關信息，提示這些miRNA可能顯著影響腫瘤轉移及惡性轉化。因此需要進一步研究以確定miRNA差異表達的分子機制，并探究這些miRNA如何促進腫瘤轉移。

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