樺褐孔菌的不同提取物對胃癌BGC－823細胞株生長抑制作用的體外觀察

崔 濤 鐘秀宏 楊淑艷 趙麗微 關(guān)曉輝 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 吉林 320)

樺褐孔菌屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬，學(xué)名:Fuscoporia obliqua(Pers.Fr.)Aoshi或 Inonotus obliquus(Fr.)Pilat，俄語名為:Chaga〔1〕。16 世紀(jì)至今，東歐一些國家的民間就用這種菌的菌核來防治癌癥、心臟病、肝病、胃病等。近年來樺褐孔菌引起俄羅斯、北歐、日本、美國及韓國等國家的相關(guān)學(xué)者的重視，已經(jīng)分離出栓菌酸、三萜類化合物、類固醇、樺褐孔菌醇等成分，有報道樺褐孔菌提取物對胃癌 MGC-803、結(jié)腸癌 SNU-484、宮頸癌 HelaS3、肺癌 A549和人類乳腺癌MCF-7等腫瘤細胞的增殖有抑制作用，并促進腫瘤細胞的凋亡〔2，3〕。本研究利用MTT比色法，比較不同提取方法獲得的樺褐孔菌提取物對胃癌BGC-823細胞株生長的抑制作用，為提取分離樺褐孔菌中高效抗胃癌有效單體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 樺褐孔菌水提取物由延邊圣霖菌業(yè)有限公司提供，石油醚提取物(醚提取物)、乙酸乙酯提取物(酯提取物)由延邊大學(xué)藥學(xué)院提供。人胃癌細胞株BGC-823購自中科院上海細胞所。無支原體胎牛血清、噻唑藍(MTT)為北京華美公司產(chǎn)品。RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。二甲基亞砜(DMSO)為江蘇鴻聲化工廠產(chǎn)品。胰蛋白酶(Tripsin)為Difco公司產(chǎn)品。

1.2 樺褐孔菌提取液的制備 取樺褐孔菌1.28 kg，粉碎，用95%乙醇回流提取，減壓回收溶劑，得到醇提取物57 g。殘渣進行水煎煮，煎煮液加乙醇放置產(chǎn)生大量沉淀，抽濾后濾液再加95%乙醇使含醇量達80%，過濾、沉淀、低溫干燥后得到粗制多糖，再溶解于水進行乙醇反復(fù)醇沉，沉淀用丙酮洗滌抽濾干燥得到精制多糖。

醇提取物中加水使其充分分散后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分別得到石油醚萃取物3.10 g和乙酸乙酯萃取物29.40 g。乙酸乙酯萃取物反復(fù)進行常壓硅膠柱層析分離，分別用石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇進行梯度洗脫分離，重結(jié)晶得到化合物Ⅰ和化合物Ⅱ;給石油醚萃取物反復(fù)進行常壓硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫分離，重結(jié)晶得到化合物Ⅲ，三個化合物均屬羊毛甾烷醇的三萜類化合物〔4〕。

1.3 細胞培養(yǎng) 細胞株生長于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，另加青、鏈霉素各100 kU/L，置于37℃ 、5%二氧化碳及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胃癌細胞生長旺盛，于實驗前24 h半量換液，用0.4%苔盼藍染色3 min，觀察活細胞。本實驗所用的細胞活性在98%以上。

1.4 實驗分組及藥物處理 胃癌BGC-823細胞株隨機分為對照組和不同方法提取的各樺褐孔菌提取物組，即樺褐孔菌水提取物組、石油醚提取物組、乙酸乙酯提取物組，每個組又分為10、20、40、80 g/ml四個劑量組。各組分別在培養(yǎng)48 h時收集腫瘤細胞并觀察細胞的變化。

1.5 藥物毒性實驗 樺褐孔菌提取物對胃癌BGC-823細胞株的細胞毒作用，采用MTT比色法，計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率。藥物抑制率(%)=〔1－(實驗組A值－對照組 A值)/對照組A值〕×100%，A值為492 nm實驗波長下測定的每孔的光吸收值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

樺褐孔菌水提取物、醚提取物、酯提取物在10～80 g/ml范圍內(nèi)對胃癌BGC-823細胞株均有抑制作用，并表現(xiàn)出濃度依賴性關(guān)系。樺褐孔菌酯提取物組10、20、40、80 g/ml各作用腫瘤細胞48 h時，其抑制率分別為21%、33%、49%、62%;醚提取物組分別為17%、35%、39%、60%;水提取物組分別為20%、36%、47%、51%。80 g/ml醚提取物和酯提取物的抑制率和水提取物之間有顯著性差異(P＜0.01);相同濃度醚提取物和酯提取物對人胃癌細胞BGC-823細胞株抑制作用無差異(P＞0.05)。見圖1。

圖1 樺褐孔菌的不同提取物作用于人胃癌BGC-823細胞株48 h的抑制

3 討論

人們在動物實驗〔5〕中發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌提取物具有明顯的腫瘤抑制作用。本結(jié)果以樺褐孔菌醚提取物和酯提取物的抑制率明顯。樺褐孔菌水提取物主要成分有多酚化合物單寧酸、多糖及可溶性蛋白質(zhì)和脂肪等。單寧酸是一種廣泛分布在植物體內(nèi)的多酚類化合物，具有抗誘變、抗腫瘤、抗癌的作用，對肺、皮膚、胃、結(jié)腸癌細胞有很好抑制作用〔6〕。Cui等〔7〕也發(fā)現(xiàn)多酚化合物具有細胞毒作用、清除自由基和很強的抗氧化作用。真菌水提取物多糖中，水溶性較高的葡聚糖的生物活性較高，β-1，3-D-葡聚糖具有抑制腫瘤生長的生物活性，真菌多糖對多種腫瘤具有抗腫瘤作用〔8〕。

He等〔9〕將樺褐孔菌醚提取物中分離出三種新的羥脂甾烷三萜類化合物，趙芬琴等〔4〕分離出 3，22 R-dihydroxy-lanosta-8，24-diene(inotodio1)，是樺褐孔菌的抗突變活性成分，Cui等〔7〕發(fā)現(xiàn)三萜類具有細胞毒作用、清除自由基和抗氧化作用。本實驗提示醚提取物和酯提取物活性成分三萜類化合物有較強的抗腫瘤作用。

關(guān)于樺褐孔菌提取物的抗腫瘤作用機制還不十分清楚。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌的水提取物對體外的人類子宮頸腫瘤細胞HelaS3，通過影響有絲分裂指數(shù)和酶活性來抑制腫瘤細胞生長〔3，10〕。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)水提取物、醚提取物、酯提取物均能抑制多種腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，其機制可能與腫瘤細胞阻滯于細胞周期的S期〔11，12〕，和通過線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡有關(guān)。

以上實驗研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌3種提取物在體外均能抑制胃癌細胞株BGC-823增殖，其中醚提取物、酯提取物抑制率最高。本實驗結(jié)果提示，樺褐孔菌3種提取物中，除了多糖、多酚類化合物外，通過醚和(或)酯提取法提取分離的樺褐孔菌中的三萜類單體，對進一步研究樺褐孔菌的抗腫瘤作用具有重要意義，應(yīng)繼續(xù)深入研究。

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6 馬志紅，陸忠兵，石 碧.單寧酸的化學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用〔J〕.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003;15(1):87-91.

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12 鐘秀宏，孫東植，崔基成，等.樺褐孔菌提取物對人胃癌BGC-823細胞株的抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用〔J〕.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報，2006;29(2):82-6.