α－硫辛酸對糖尿病大鼠糖外周組織內UCP2 mRNA表達的影響及意義

張 梅 李 萍 孫海玲 李艷英 班 博 (濟寧醫學院附屬醫院內分泌科，山東 濟寧 272000)

2型糖尿病以胰島素抵抗和β細胞功能缺陷為主要的病理生理基礎，胰島素抵抗是指胰島素的靶器官 (包括骨骼肌、脂肪等)對一定量的胰島素的生物學反應低于預計正常水平的一種現象，它可導致胰島素介導下的骨骼肌、脂肪組織對葡萄糖的攝取、利用或儲存的效力減弱，機體胰島β細胞代償出現高胰島素血癥，并逐漸出現高血糖。正常狀態下骨骼肌及脂肪組織對葡萄糖的攝取是維持體內葡萄糖代謝合成平衡重要因素。目前國內外眾多的研究已證實UCP2可以通過影響ATP的生成、調節胰島素的分泌、抑制氧自由基 (ROS)的生成、誘發胰島β細胞的凋亡等參與糖尿病的發生發展過程，并也因此成為了治療2型糖尿病的新的研究熱點。本研究通過觀察2型糖尿病糖尿病大鼠糖脂代謝、氧化應激水平及UCP2 mRNA表達水平及之間的相互影響，并觀察α－硫辛酸 (LA)對其的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試驗儀器與藥品 微量血糖儀(One TouchⅡ型，美國強生公司)及相應型號試紙，糖化血紅蛋白(HbAlc)測定儀(BIO－RAD REF 220－0101)，全自動生化分析儀(HITACHI 7600－120)，電子天平(上海良平YP6001)，鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，LA(產品批號 2574)購自德國STADA公司，總RNA提取試劑Trizol及CR SuperMix購自美國Invitrogen公司，瓊脂糖購自北京世紀銀豐科技發展中心，丙二醛(MDA)及總抗氧化能力(T－AOC)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠30只，體重180～200 g，購自山東省新華魯抗動物實驗中心(許可證號為:SCXK魯20080002)，飼養溫度(22±1)℃，濕度40% ～60%，光－暗周期12 h。用普通飼料適應性喂養7 d后隨機分為對照(NC)組8只和實驗組22只，NC組繼續普通飼料喂養，實驗組改用高脂飼料喂養，基礎飼料購自山東省新華魯抗動物實驗中心，高脂飼料是在60%的基礎飼料中加入5%蛋黃粉、20%蔗糖和15%豬油混合而成。飼養期間大鼠的精神狀態、攝食、飲水及活動情況均未見明顯異常，無死亡。

1.3 方法 實驗組大鼠高脂飼養4 w后，禁食12 h，將STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.2)溶液中，配成濃度為1%的溶液，單次腹腔注射30 mg/kg，NC組給予等量的枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射，72 h后尾靜脈測血糖，血糖＞16.7 mmol/L為造模成功，共成模18只，隨機選取16只成模者納入本實驗，繼續高脂飲食4 w后隨機分為LA、糖尿病(DC)組，每組8 只，分別給予 LA 60 mg·kg－1·d－1、生理鹽水2 ml/d 4 w，實驗期間，動物自由攝食和飲水。每周測一次血糖和體重。

1.4 標本收集與檢測 用藥4 w后，禁食12 h，1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，開胸，胸主動脈抽血檢測HbA1c、血糖、血脂，取出肝臟－80℃冰箱凍存備用測 AMPKα。親和層析微柱法測HbA1c，血糖血脂胰島素由全自動生化分析儀及全自動電化學免疫分析儀測定;應用RT－PCR檢測脂肪、骨骼肌組織UCP2 mRNA的表達水平;應用比色法測定肝臟內 MDA及 T－AOC水平。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0軟件，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組體重變化 造模1 w后即在飼養5 w后NC組與DC、LA組相比差異顯著(P＜0.05)，DC組與LA組間體重無差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠空腹血糖(FBG)、HbA1c及胰島素水平比較造模前各組大鼠FBG無明顯差異(P＞0.05)，至造模后實驗組較正常組相比較FBG明顯升高，且胰島素亦明顯升高(P＜0.01);LA組與DC組比較FBG顯著降低，胰島素明顯下降(P＜0.05);各組大鼠HbA1c水平比較，與FBG變化趨勢一致。見表2。

2.3 各組大鼠血脂水平比較 與NC組相比較，DC組、LC組甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)均升高，高密度脂蛋白(HDL)下降(P＜0.05)，但LC組與NC組相比游離脂肪酸(FFA)無明顯差別(P＞0.05);與DC組相比較LA組TG、TC、LDL均有下降，HDL有明顯升高(P＜0.05或 P＜0.01)。見表3。

表1 各組大鼠體重變化(n=8，g，)

表1 各組大鼠體重變化(n=8，g，)

與NC組比較:1)P＜0.05

組別 1 w 造模后 用藥前 用藥后NC 196.5±9.4 347.5±13.0 411.3±16.2 421.9±15.2 DC 193.9±7.0 344.4±14.7 354.4±15.21)360.3±15.11)LA 195.0±9.7 361.0±14.7 359.4±17.21)365.0±16.31)

表2 各組大鼠FPG、HbA1c、胰島素水平比較(n=8，)

表2 各組大鼠FPG、HbA1c、胰島素水平比較(n=8，)

與NC組比較:1)P＜0.01;與DC組比較:2)P＜0.05

組別 FBG(mmol/L) 胰島素 HbA1c(%)NC 4.94±0.512) 8.51±1.272) 4.8±0.672)DC 23.32±2.871) 19.1±1.601) 13.0±1.561)LA 20.6±2.321)2) 14.08±1.791)2) 10.1±2.101)2)

表3 各組大鼠血脂水平比較(n=8，mmol/L，)

表3 各組大鼠血脂水平比較(n=8，mmol/L，)

與 NC組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與 DC組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01，下表同

組別TG TC LDL HDL FFA NC 0.48±0.164) 1.33±0.234) 0.31±0.064) 1.00±0.164)0.33±0.11 DC 3.75±0.452) 3.08±0.272) 1.46±0.282) 0.82±0.192) 0.53±0.102)LA 2.20±0.402)3) 2.21±0.311)3) 0.85±0.123) 0.95±0.223) 0.40±0.113)

2.4 各組大鼠脂肪及骨骼肌組織內MDA、T－AOC的比較 與NC組比較，DC組LA組大鼠脂肪及骨骼肌組織內MDA含量均有升高，而T－AOC均有下降(P＜0.05或者P＜0.01);與DC組比較，LA組大鼠脂肪及骨骼肌組織中MDA含量均有下降，T－AOC均有升高(P＜0.05或P＜0.0)。見表4。

表4 各組大鼠不同組織內MDA水平的比較(nmol/mgprot，n=8，)

表4 各組大鼠不同組織內MDA水平的比較(nmol/mgprot，n=8，)

組別 骨骼肌 脂肪NC 2.31±0.894) 1.33±0.234)DC 6.43±1.222) 3.08±0.272)LA 5.24±1.072)3) 2.21±0.311)3)

2.5 各組間UCP2 mRNA表達水平的比較 算出每個樣品及GDAH的灰度值。并用UCP2的灰度值除以GDAH灰度值得出比值(OD比值)。將以上數據統計分析。與NC組比較，DC組、LA組脂肪及骨骼肌組織內UCP2 mRNA的表達明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，但在脂肪組織中的表達無明顯差異(P＞0.05);與DC組比較LA組各組織內UCP2 mRNA的表達均明顯下降(P＜0.05)。見表5及圖1、圖2。

圖1 各組骨骼肌組織內UCP2 mRNA的表達

表5 各組大鼠不同組織內UCP2 mRNA表達水平(OD比值)的比較(n=8，)

表5 各組大鼠不同組織內UCP2 mRNA表達水平(OD比值)的比較(n=8，)

組別 脂肪 骨骼肌NC 0.92±0.064) 0.77±0.104)DC 1.10±0.052) 1.05±0.082)LA 0.97±0.074) 0.95±0.062)3)

圖2 各組脂肪組織內UCP2 mRNA的表達

3 討論

解耦聯蛋白2(UCP2)是一種解耦聯劑，它是線粒體內膜載體家族的一員，作為線粒體內膜上參與質子轉運的蛋白質，它具有控制活性氧產生、調節能量平衡、調節ATP產生速度、抗細胞凋亡等生理功能，參與許多疾病的病理生理學過程。實驗研究提示其表達或功能異常與代謝性疾病及肥胖相關。

UCP2的表達受脂肪酸、血糖及一些激素調節的影響。目前脂肪酸對非胰島組織UCP2的誘導作用已經得到了證實〔1〕。應用油脂酸培養肝細胞12～16 h，結果顯示肝細胞內 UCP2 mRNA的表達增加8倍以上。同時亦有動物實驗的研究〔2〕表明用脂肪乳持續灌注大鼠24 h能顯著增加其心臟和骨骼肌中UCP2的表達。本研究顯示糖尿病大鼠TG、TC、LDL及FFA明顯升高，同時HDL明顯降低，并且其骨骼肌及脂肪組織內UCP2 mRNA的表達均明顯升高，與以往研究結果一致。有研究〔3～5〕表明α－硫辛酸可通過多種機制調節糖尿病狀態下的脂代謝紊亂，本研究結果證實了LA對脂代謝的調節作用及血脂對UCP2 mRNA的調節作用。血脂對UCP2 mRNA表達的調節機制尚不明確，有細胞內的實驗研究〔6〕表明，其可能機制為通過未酰化的脂肪酸激活過氧化物酶體激活受體 γ(PPAR γ)作用于UCP2 mRNA的啟動調控區，而被此作用元件調控而上調表達。

目前高血糖對UCP2的影響結果不盡相同。Hjeltnes等〔7〕通過給予給予大鼠葡萄糖負荷后檢測肌肉中UCP2 mRNA的表達水平，發現其與血漿葡萄糖水平呈正相關。UCP2基因敲除小鼠體內胰島素水平升高，雜合型(UCP2+/－)鼠的胰島素分泌能力介于野生型(UCP2+/+)和基因敲除型(UCP2－/－)之間〔8，9〕。Krauss 等〔10，11〕的研究表明高血糖能上調胰島細胞線粒體的UCP2表達，同時ROS的產生增加，進而抑制胰島素的分泌，在協同高脂的環境下，ROS生成的增多誘導UCP2的表達增多，UCP2的超表達將進一步抑制胰島素分泌，加重高血糖。本研究結果顯示糖尿病大鼠血糖及胰島素水平均升高，同時外周組織中UCP2mRNA表達增加。但也有研究〔12〕表明糖尿病病狀態下機體外周組織內UCP2 mRNA的表達較正常機體下降。其結果與上述結果不盡相同可能與動物實驗時間、實驗方法、實驗技術及樣本量等有關。國內外的研究均已證實〔13～15〕LA對糖尿病大鼠血糖具有調節作用，本研究證實了高血糖可增加UCP2 mRNA的表達，認為高糖血癥上調UCP2 mRNA的表達可能是機體用來限制血糖無限升高的一種適應機制，其機制尚不明確。同時也證實了UCP2是β細胞胰島素分泌的一個重要的調節因子，認為可能是UCP2通過解耦聯作用導致ATP合成減少進而出現ATP/ADP比值降低，使ATP敏感性K+通道(K+－ATP通道)關閉，出現細胞膜去極化，從而通過打開電壓門控鈣通道，導致Ca2+內流的增加，進而促進β細胞通過胞吐作用將胰島素釋放，機體為此所必須付出的代價是能量通過UCPs的作用以熱能的形式被消耗，而不是以 ATP形式被儲存，UCP2的這種質子傳遞作用能被細胞內的ADP抑制。

UCP2被認為是介導線粒體ROS的生成，最近的很多研究都證實UCP2是不同組織 ROS生成的調節器〔16～18〕，更有趣的是研究發現〔10，18，19〕，UCP2 可調節 ROS 的生成，同時 ROS 分子可激活UCP2，UCP2對 ROS的調節是一個負反饋。Li等〔20〕的研究發現，氧化應激可使胰島β細胞和肥胖者肝細胞中UCP2表達增加，表達增高的UCP2可增強β細胞H2O2毒性的對抵抗力。上述研究表明UCP2可調節ROS的生成，同時也顯示UCP2的表達也受ROS分子的調節。眾多的臨床及動物研究已證實糖尿病狀態下機體抗氧化能力下降，氧化應激明顯增強〔21～25〕。本研究提示糖尿病狀態下機體的氧化－抗氧化系統失調，抗氧化能力明顯下降，氧化應激明顯增強，與上述研究結果一致。LA可以通過調節氧化系統與抗氧化系統之間的平衡，改善糖尿病機體的氧化應激水平，并且本研究潛在的提示了氧化應激水平與UCP2 mRNA的表達水平兩者是一個負反饋。

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