金屬硫蛋白1H在晚期非小細胞肺癌中的表達及預后分析

許林平，張瑞芳，馬 臣，樊青霞，買 玲

(1.河南省腫瘤醫(yī)院 河南鄭州 450008;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院 河南新鄉(xiāng) 453003;3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內科 河南鄭州 450052)

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織2008年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)在每年肺癌新發(fā)病例約160萬例，占所有癌癥新發(fā)病例的12.7%［1］。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的80% ～85%，確診時約2/3的患者為不可切除的晚期患者［2］。鉑類抗癌藥一直是治療非小細胞肺癌的主要藥物，特別是順鉑類抗癌藥。目前仍以含鉑方案化療作為治療晚期非小細胞肺癌的主要手段。20世紀90年代以來，隨著第3代抗癌藥物的出現(xiàn)［健澤(gemcitabine)、諾維本(vinorelbine)、泰素(taxol)、泰索帝 (taxotere)、伊立替康 (CPT-11)］，晚期肺癌病人的治療效果有了一定的提高，非鉑類治療方案也成為一種較好的選擇。如何在現(xiàn)有基礎上進一步提高鉑類藥物使用的針對性，成為臨床研究熱點。金屬硫蛋白(MT)是生物體內普遍存在的一類金屬結合蛋白，人MT基因是包括10個功能性基因和7個非功能性基因的異構體，MT1H是其中一個功能性基因。研究證實，細胞內含巰基蛋白以MT為主，而腫瘤細胞耐藥與細胞解毒體系含巰基蛋白的過量表達有關。故MT在腫瘤耐藥中的作用，尤其是順鉑(DDP)耐藥已引起臨床關注。已發(fā)現(xiàn)MT與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，但其各種異構體的功能尚不完全清楚［3］。我們回顧性分析了2006年5～9月所有入院非小細胞肺癌病人的MT1H表達與晚期非小細胞肺癌(NSCLC)臨床病理特征及其與病人生存的關系，試圖篩選出預測腫瘤耐藥的指標，以提高臨床化療的針對性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院2006年5～9月完成含鉑方案(Gemcitabine+DDP或NVB+DDP方案)化療2個完整周期的40例可靠NSCLC的病歷資料(均為喪失手術時機或不愿手術、放療的初治患者，均經病理診斷確診)。其中男性25例，女性15例，平均年齡58歲。參照WHO分類標準，其中鱗癌(SC)17例，腺癌(AC)23例;高、中分化癌19例，低分化癌21例;按國際肺癌TNM分期標準，Ⅲa期7例，Ⅲb期16例，IV期17例。有淋巴結轉移者19例，無轉移者21例。

1.2 治療方法 40例患者均有2個周期完整的含順鉑方案(Gemcitabine+DDP或異長春花堿+DDP方案)治療，化療前及化療第2周期的第5～6周分別抽取外周血，并拍攝胸片或胸部CT。根據(jù)WHO療效標準，完全緩解或部分緩解者為化療有效，穩(wěn)定者或進展者為化療無效。40例患者中有39例有完整的隨訪資料，生存期自化療首日至死亡或失訪日止。隨訪48～1 095 d，中位隨訪 264 d，平均隨訪 414.61 d。

1.3 MT-1H 基因檢測

1.3.1 總RNA的提取:采取患者外周靜脈血2 ml加入2%乙二胺四乙酸鹽(1∶9)抗凝，迅速送檢。采用分離試劑提取RNA。紫外分光光度計測定RNA含量和純度。

1.3.2 RT-PCR檢測:用AMV逆轉錄酶制備cDNA，取cDNA進行PCR擴增。MT1H引物為:P1，5’-CCA GTC TCA CCT CGG CTT G-3’;P2，5’-TAG CAA ATG AGT CGG AGT TGT-3’，擴增片段大小為294 bp。βaction(作為內參照)引物為:P1，5’-CAT CCT GCG TCT GGA CCT-3’;P2，5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3’，擴增片段為480 bp。擴增條件為:94℃2 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán);72℃ 5 min。

1.3.3 結果判斷:取 5 μl擴增產物，用含 EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳。在VDS800凝膠成像系統(tǒng)中半定量分析，每份標本均觀察到480 bp位置的β-action特異性擴增條帶，證實逆轉錄所得的cDNA的完整性以及PCR反應成功。MT1H陽性結果為兩條帶:MT1H為294 bp，β-action為480 bp。以兩條帶之積分光密度比值反映MT1H基因的相對表達水平。其標準為 MT1H/β-action ≥0.2 為陽性表達，MT1H/β-action＜0.2時為陰性表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0進行分析。半定量結果用±s表示，經方差齊性檢驗后行t檢驗和單因素方差分析(檢驗水準α=0.05)。生存分析用Ka-plan-meier法和Cox回歸分析。

2 結果

2.1 化療前后MT1H表達 40例患者化療后MT1H表達(0.53 ±0.23)明顯高于化療前(0.43 ±0.26)，化療前后比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 化療前MT1H表達與臨床病理特征的關系 化療前MT1H表達與患者性別、年齡、腫瘤組織學類型和TNM分期無關(P＞0.05);AC與腫瘤的分化程度及是否淋巴結轉移有關，即MT1H在高、中分化肺癌的陽性表達比低分化肺癌陽性表達低，無淋巴結轉移陽性表達比有淋巴結轉移陽性表達低(P均＜0.05)。見表1。

2.3 化療效果與化療前后MT1H表達 40例中有效21例，無效19例?；熐昂驧T1H表達在有效組中差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，無效組中差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?；熐昂驧T1H表達差值在有效組中是(0.04 ±0.31)，無效組中是(0.18 ±0.20)，兩組相比差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.69，P＞0.05)。見表2。

表1 化療前MT1H表達與NSCLC患者臨床病理特征關系

表2 有效組與無效組化療前后MT1H表達差異比較 (±s)

表2 有效組與無效組化療前后MT1H表達差異比較 (±s)

注:*表示有效組和無效組化療前后表達差值比較。

組別 n 化療前 化療后 t P MT-1H表達差異MT-1H t P有效 21 0.45 ±0.32 0.49 ±0.16 －0.560 0.582 0.04 ±0.31 －1.69 0.10*無效 19 0.41 ±0.19 0.58 ±0.29 －3.905 0.001 0.18 ±0.20

2.4 PCR擴增產物電泳圖 見圖1、圖2。

2.5 MT表達與患者生存的關系

2.5.1 預后因素的單因素分析:MT陰性組中位生存期是304 d，陽性組是246 d，提示MT高表達可能會導致晚期非小細胞肺癌的預后較差，但用Kaplan-meier法進行單因素的生存分析得 χ2=1.6，P=0.206，差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

2.5.2 Cox 回歸模型多因素分析［4，5］:應用 Cox 模型強制進入法分析患者的性別、年齡段、病理分型、分期、分化程度、淋巴結轉移情況、MT等多個因素對晚期NSCLC生存的影響。結果顯示年齡段是影響晚期NSCLC預后的獨立因素，MT可能是影響晚期NSCLC預后的獨立因素。見表3。

圖3 MT陽性組與陰性組生存曲線

表3 40例NSCLC患者的COX預后多因素回歸分析

3 討論

由于NSCLC早期診斷率低，約80%的患者就診時己失去手術機會。第3代抗癌藥的聯(lián)合化療有效率僅為30% ～40%，5年生存率不足15%［6］。化療失敗的主要原因是腫瘤對化療藥物的原發(fā)性耐藥及獲得性耐藥。研究顯示，MT與腫瘤耐藥有關，但在人發(fā)育不同時期或在不同生理條件下不同MT異構體功能不同。本文結果證實，本研究中40例NSCLC患者，化療后MT1H表達相對化療前有增高趨勢，提示可能存在化療后的獲得性耐藥。Oguri等［7］認為，此與體內化療藥物誘導和對異生化合物生理壓力反應有關。本研究結果顯示，MT1H在NSCLC中的表達與患者的性別、年齡、TNM分期無關，并且在AC中的表達強度無統(tǒng)計學差異，說明組織學類型與MT1H的表達無明顯相關性。淋巴結轉移及腫瘤分化程度與MT1H的表達有相關性，隨著分化程度的降低MT1H的表達逐漸增強，提示NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中可能有MT1H的參與。這與乳腺癌和食管癌等腫瘤中MT的表達報道一致［8］。MT1H在惡性較高的NSCLC中更趨于表達，表明MT1H很可能是一種反映腫瘤惡性程度的生物學指標，有可能作為臨床確定治療方案及判斷預后實驗室指標的參考依據(jù)。目前關于MT1H與臨床療效的關系尚無定論。Wood等［9］研究認為，MT表達與膀胱癌含順鉑方案化療敏感性無關;Kotoh等［10］認為，在泌尿系移形細胞癌中MT表達水平與含順鉑方案化療敏感性呈負相關。本研究顯示，MT1H表達與化療效果無明顯相關性，尚不能預測化療療效。多數(shù)報道認為MT表達與生存情況為負相關的關系，如用含順鉑方案化療的泌尿系腫瘤，MT蛋白與生存有關［11］。丁華野等［12］研究認為，MT 表達與乳腺癌生存呈負相關，Joseph等［13］認為MT表達與小細胞肺癌生存呈負相關。本研究顯示MT表達情況可能與采用含鉑方案化療病人的生存情況呈負相關，但經統(tǒng)計學檢驗差異無統(tǒng)計學意義，這可能與化療對晚期非小細胞肺癌生存改善有限有關。此外，患者入院時肺癌的分期情況、后續(xù)采取治療方案的情況及治療時病人的心態(tài)都會對生存情況產生影響。同時未做亞組分析，可能也會對結果產生一定的影響。另外，本研究可能存在一些其他的因素未被排除，從而對結果產生影響。若想進一步研究，提高預測的準確性及化療選藥的針對性，需增加樣本例數(shù)，采用隨機分組，并采用多個可能對研究有影響的耐藥指標進行聯(lián)合檢測。

［1］ Ferlay J，Shin H R，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008［J］.Int J Cancer，2010，127(12):2893-2917.

［2］ Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2007［J］.CA Cancer J Clin，2007，57:43-66.

［3］ Bozena W，Bartosz P，Beata M，et al.Correlation between erxpression of metallothionein and expression of Ki-67 and MCM-2 proliferation markers in non-small cell lung cancer［J］.Anticancer research，2011，31(9):2833-2840.

［4］ 劉苓霜，姜怡，沈麗萍，等.中醫(yī)藥干預老年晚期非小細胞肺癌患者的生存分析［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2011，25(6):26-29.

［5］ 林勇斌，梁穎，李明毅，等.208例手術切除的ⅢA-N2期非小細胞肺癌患者的生存分析［J］.重慶醫(yī)學，2011，40(24):2404-2409.

［6］ Walker S.Updates in non-small cell lung cancer［J］.Clin J Oncol Nurs，2008，12(4):587-683.

［7］ Oguri T，F(xiàn)ujwara Y，Miyazaki M，et al.Induction of gamma glutamylcysteine synthetase gene expression by platinum drugs in peripheral mononuclear cells of lung cancer patients［J］.Ann Oncol，1999，10(4):455-460.

［8］ Hishikawa Y，Koji T，Dhar D K，et al.Metallothionein Expression correlates with metastatic and proliferative potential in squamous cell carcinoma of the esophagus［J］.Br J Cancer，1999，81(4):712-720.

［9］ Wood D，Klein E，F(xiàn)air W，et al.Metallothionein gene expression in bladder cancer exposed to cispiatin［J］.Mod Pathol，1993，6(2):33-34.

［10］ Kotoh S，Naito S，Sakamoto N，et al.Metallothionein expression is correlated with cisplatin resistance in transitional cell carcinoma of the urinary tract［J］.Urol，1994，152(4):1267-1270.

［11］ Siu L，Banerjee D，Khurana F，et al.The prognostic role of p53，metallothionein，P-glycoprotein，and MIB-1 in muscle-invasive urothelial transitional cell carcinoms［J］.Clin Cancer Res，1998，4(3):559.

［12］丁華野，皋嵐湘，鄧永江，等.金屬硫蛋白在乳腺癌組織中過表達的臨床病理意義［J］.中華醫(yī)學雜志，1997，77(11):860-862.

［13］ Joseph M G，Banerjee D，Kocha W，et al.Metallothionein expression in patients with small cell carcinoma of the lung［J］.Cancer，2001，92(4):836-842.