HPLC-MS法測定食品中生物堿的研究

秦軍燕，陳 文，夏寅強，瞿德敬，方國臻，王 碩

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457）

HPLC-MS法測定食品中生物堿的研究

秦軍燕，陳 文，夏寅強，瞿德敬，方國臻，王 碩*

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457）

建立了一種高效液相色譜電噴霧質譜（HPLC-ESI-MS）法同時測定食品中六種生物堿的方法。采用ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm）色譜柱，乙腈（A）和pH5的4mmol/L乙酸銨溶液（B）為流動相，梯度洗脫使所有分析物均達到基線分離。采用ESI+一級質譜掃描模式得到甜菜堿、膽堿、苦參堿、阿托品、馬錢子堿和烏頭堿的定性離子，分別為m/z 118.2、104.2、249.5、290.3、395.4和646.4，結合質譜保留時間檢測六種生物堿。結果表明，采用1.0mg/mL混合標準溶液，準確性好，RSD＜0.59%。該方法應用于檢測實際樣品荒漠肉蓯蓉、山藥、寧夏枸杞，添加回收率分別為81.7%～112.9%、80.8%～117.5%、96.9%～119.3%，說明建立的方法可以快速準確的檢測實際樣品中的生物堿成分。

高效液相色譜，電噴霧質譜，生物堿，實際樣品

Abstract：An high-performance liquid chromatographic electrospray ionization mass spectrometry（HPLC-ESIMS） method was developed for the identification of 6 alkaloids in food.A mixture of acetonitrile（A） and pH5 4mmol/L ammonium acetate aqueous solution（B） were used as the mobile phase for the chro-matographic separation on ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm） column in the gradient elution mode.Under positive electrospray ionization mode，the protonated molecular[M+H]+ions for betaine（m/z 118.2），choline（m/z 104.2），matrine（m/z 249.5），atropine（m/z 290.3），brucine（m/z 395.4） and aconitine（m/z 646.4） and retain time were obtained as qualitative analysis.The experiment results indicated that RSD of the precision was less than 0.59%for adding 1.0mg/mL of spike standard.This method was used in the actual sample Herba Cistanche，Rhizoma Dioscoreae，Lycium bar-barum L testing and the average extraction recoveries were in the range of 81.7%～112.9%，80.8%～117.5%，96.9%～119.3%.A simple，rapid and accurate identification of 6 alkaloids was successfully achieved using the method.

Key words：liquid chromatography；electrospray ionization mass spectrometry；alkaloids；actual sample

肉蓯蓉、枸杞和山藥既是名貴的中藥材，又是食療同源的滋補產品，具有抗腫瘤、增強人體免疫力及維護心血管健康等功效。根據報道枸杞、肉蓯蓉和山藥均含有大量活性成分生物堿[1-4]，目前對該成分的檢測方法有比色法[5]、高效液相色譜法[6-8]、液相質譜聯用法[9-11]等。比色法測定過程復雜，而且需要乙醚等有機試劑，對人體危害較大。由于甜菜堿和膽堿結構中無共軛體系，高效液相色譜法僅能在低紫外吸收波長條件下測定，條件要求較高，靈敏度不夠理想，或是衍生操作相對繁瑣。目前雖然有采用高效液相質譜聯用法測定生物堿成分的研究，但同時測定甜菜堿、膽堿、阿托品、苦參堿、馬錢子堿及烏頭堿六種生物堿的液相質譜方法還未見報道。本實驗利用液相質譜法建立一種同時測定這六種生物堿的儀器檢測方法，用于原料肉蓯蓉、山藥和枸杞中的生物堿成分測定，方便快速、簡便，為其功效成分分析提供檢測依據，對合理的利用和開發食療同源的原材料具有很好的社會和經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜菜堿、膽堿、阿托品、苦參堿、馬錢子堿、烏頭堿標準品 Sigma公司，純度均＞95%；乙腈、甲醇 美國Merck公司產品，色譜純；甲酸、乙酸銨 天津市光復精細化工研究所產品，色譜純；氨水 天津市風船化學試劑科技有限公司，分析純；無水乙醇 天津市北聯精細化學品開發有限公司產品，分析純；水 經Millipore超純水系統處理過的超純水。

LCQ液相色譜-質譜聯用儀：配有自動進樣器、電噴霧離子源（ESI）、LCQ離子阱（ion trap）及Xcalibur1.4數據處理系統 美國Finnigan公司產品；ZORBAX SB-C8色譜柱（2.1mm×150mm，3.5μm） 美國Agilent；Centrifuge5804R臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司產品；Millipore超純水系統 美國Millipore公司產品；VGT-1730QT超聲波清洗儀 美瑞泰克公司產品。

1.2 實驗方法

分別稱取0.5000g肉蓯蓉粉末、山藥粉和枸杞粉末，各加入10mL 20%乙醇水溶液，55℃超聲輔助提取30min，在25℃下，4500r/min離心分離20min，重復提取2次，收集濾液，備用。取2.5mL提取液，置于250mL的容量瓶中，50%乙腈水溶液定容。取1mL上述溶液，經0.22μm的微孔有機濾膜過濾后進樣。

1.3 測定條件

1.3.1 質譜條件 電噴霧（ESI）離子源；毛細管溫度270℃；電噴霧電壓4.5kV；鞘氣流速9.0L/min；輔助氣流速1.5L/min；掃描方式采用正離子模式下全掃描和SIM掃描方式；質量掃描范圍：m/z 50～1000。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C8色譜柱（2.1mm×150mm，3.5μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈（A）和pH5 4mmol/L乙酸銨溶液（B）；梯度洗脫：0min，30%A；5min，70%A；10min，90%A；15min，50%A；30min，30%A；流速：0.2mL/min；進樣量：10μL。

2 結果與討論

2.1 優化質譜條件

采用1.0mg/mL六種生物堿的混合標準溶液優化質譜條件，注射泵手動進樣。

2.1.1 確立毛細管溫度 實驗分別設置了不同的毛細管溫度，在200～310℃范圍內對混合標準溶液進行掃描測定，根據目標物的質譜響應強度選擇最合適的毛細管溫度，結果表明，隨著溫度的升高，目標物的響應值增強，當超過270℃時，由于溫度過高，目標物損失增大，因此選擇毛細管溫度270℃。

2.1.2 確立毛細管電壓 通過質譜掃描優化毛細管電壓，根據目標物質譜響應強度的大小選擇合適的毛細管電壓，分別設置從0～60V的電壓，通過全掃描模式檢測混合標準溶液，在從0～30V過程中，隨著電壓的增大，目標物傳輸電離效果增強，儀器響應逐漸增大，但當再增大電壓時，目標物傳輸損失增大，信號降低，所以選擇30V為最佳電壓。

2.1.3 確立電噴霧電壓 分別設置2.0～5.5kV的電壓，根據離子響應強度選擇最合適的電噴霧電壓值，在2.0～4.5kV過程中，噴霧電壓的增大有利于目標物更好的充分發生電離，儀器信號逐漸增強，但過高的噴霧電壓能夠造成目標離子傳輸過程中的損失增大，所以選擇4.5kV為最佳電壓。

2.1.4 選定定性離子 根據以上優化條件，采用正離子掃描檢測模式，ESI電離源條件下堿性化合物很容易加合質子，形成準分子離子峰[M+H]+和[2M+H]+，也會形成少量金屬離子綴合物的[M+Na]+和[2M+Na]+形式，這些準分子離子峰的信息對應于生物堿化合物的分子量信息，為所測定樣品是否是目標成分提供科學判據。在上述質譜條件下，甜菜堿、膽堿、苦參堿、阿托品、馬錢子堿和烏頭堿的質譜圖見圖1，分別選定m/z是118.2、104.2、249.5、290.3、395.4和646.4的準分子離子峰作為甜菜堿、膽堿、苦參堿、阿托品、馬錢子堿和烏頭堿的定性離子。

圖1 甜菜堿（a）、膽堿（b）、苦參堿（c）、阿托品（d）、馬錢子堿（e）和烏頭堿（f）標準品在正離子模式下的質譜圖Fig.1 Qualitative ion information of six alkaloids standard under positive ion mode

2.2 液相條件的確定

2.2.1 選擇色譜柱 根據報道常采用C18和C8系列色譜柱，本實驗選擇Hypersil GOLD C18（2.1mm×100mm；Thermo）；ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm；Agilent）；ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm×150mm，5.0μm；Agilent）和ZORBAX Eclipse Pluse C18（2.1mm×150mm，3.5μm；Agilent）四種色譜柱；經過優化，采用色譜柱ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm；Agilent），可以達到基線分離且具有對稱的峰形。

2.2.2 優化流動相梯度 采用梯度洗脫，通過不同梯度優化，在如下梯度洗脫時目標物得到較好的基線分離和峰型，因此選擇梯度：0min，30%乙腈70%水相；5min，70%乙腈30%水相；10min，90%乙腈10%水相；15min，50%乙腈50%水相；30min，30%乙腈70%水相。

2.2.3 優化流動相鹽溶液濃度 流動相中加入緩沖鹽可以增加目標離子的電離效果，提高其儀器響應信號，根據儀器自身的條件，選擇易揮發性的乙酸銨溶液作為流動相。分別配制濃度為0、2、4、5、6、8、10mmol/L的乙酸銨溶液，采用優化的質譜條件，結果如圖2所示，在4mmol/L六種生物堿的儀器響應已經相對達到最大，考慮緩沖鹽對質譜儀器的影響，最終選擇乙酸銨濃度為4mmol/L。

圖2 乙酸銨濃度對生物堿類物質峰面積的影響Fig.2 The effect on peak area of alkaloids about the ammonium acetate concentration

2.2.4 優化乙酸銨溶液的pH 流動相中通過添加酸調節pH可以提高電離效率，增加目標物的響應值，同時會影響各個物質的響應峰面積及保留時間，采用甲酸調節了一系列不同的乙酸銨溶液pH，分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，經過液相色譜質譜檢測，如圖3所示，當pH從3.0逐漸增大時，酸對生物堿類目標物的結構破壞降低，儀器檢測響應逐漸增大，但在pH達到5.0之后，隨著酸度降低，不利于加合質子，形成準分子離子峰，造成響應降低，所以，最終選擇乙酸銨溶液的pH為5.0。

圖3 流動相pH對生物堿類物質峰面積的影響Fig.3 The effect on peak area of alkaloids about the mobile phase pH

2.2.5 優化色譜柱柱溫 在25～40℃范圍內分別設置20、25、30、35、40℃五個溫度水平，結果表明，柱溫對生物堿成分的峰面積影響不大，考慮色譜柱使用壽命問題，選擇柱溫30℃。

按照優化好的液相色譜條件，得到六種生物堿的分離質譜圖，1～6號峰依次分別為甜菜堿、膽堿、苦參堿、阿托品、馬錢子堿和烏頭堿，如圖4所示。

圖4 六種標準品高效液相質譜圖Fig.4 The HPLC-MS of the six standard materials

2.3 精密度實驗

精密吸取1.0mg/mL混合標準溶液，在上述液相質譜條件下重復進樣6次，其六種生物堿標品的相對保留時間的相對標準偏差RSD小于0.59%，表明儀器精密度良好。

2.4 重現性實驗

平行配制6份1.0mg/mL混合標準溶液，分別測定，結果六種生物堿標準品的相對保留時間的相對標準偏差RSD小于1.19%，表明方法重現性良好。

2.5 實際樣品驗證

實驗測定了荒漠肉蓯蓉、寧夏枸杞和山藥三種實際樣品，在荒漠肉蓯蓉和寧夏枸杞的提取液中，圖5（a）、（b）中1號峰的保留時間和質譜信息與甜菜堿標準品的信息匹配，定性為甜菜堿，其余峰為雜質峰，同時根據液相質譜信息證明，兩者不含有膽堿、苦參堿、阿托品、馬錢子堿和烏頭堿。在山藥提取液中，圖5（c）中1號峰經過與標準品保留時間和質譜信息對照為膽堿，不含其他五種生物堿成分。

圖5 （a）肉蓯蓉樣品、（b）寧夏枸杞樣品、（c）山藥樣品的HPLC-MS圖譜Fig.5 The HPLC-MS of alkloid components in sample Herba Cistanche（a），Lycium barbarum（b），Rhizoma Dioscoreae（c）

分別在三種實際樣品中添加1.0mg/mL的混合標準溶液，按照1.2樣品前處理方法，平行測定三次，添加回收率分別為81.7%～112.9%、80.8%～117.5%、96.9%～119.3%，RSD分別小于8.34%、10.03%、9.77%。

3 結論

建立一種快速準確的HPLC-ESI-MS法同時識別藥食同源材料中生物堿成分，利用混合標準溶液優化質譜條件和色譜條件，方法精密度、重現性的RSD值分別小于0.59%、1.19%，將該方法用于實際樣品檢測，添加回收率分別為81.7%～112.9%、80.8%～117.5%、96.9%～119.3%，結果證明，建立的方法適合于實際樣品中的生物堿成分識別。

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Study on determination of alkaloids in food by high performance liquid chromatography mass spectrometry

QIN Jun-yan，CHEN Wen，XIA Yin-qiang，QU De-jing，FANG Guo-zhen，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering&Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

TS207.3

A

1002-0306（2012）16-0073-04

2012-01-13 *通訊聯系人

秦軍燕（1986-），女，研究生，研究方向：食品安全檢測。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK17B03）。