重金屬汞酶聯免疫檢測方法的建立

方淑兵，王俊平，王 碩，張 燕，生 威，王 津，楊依錦

（天津科技大學食品安全管理與戰略研究中心，天津300457）

重金屬汞酶聯免疫檢測方法的建立

方淑兵，王俊平*，王 碩，張 燕，生 威，王 津，楊依錦

（天津科技大學食品安全管理與戰略研究中心，天津300457）

建立了重金屬汞離子的間接競爭酶聯免疫（IC-ELISA）分析方法。由于汞離子不具有免疫原性，因此以異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE）為雙功能螯合劑連接汞離子和鑰孔血藍蛋白（KLH）作為免疫原，免疫新西蘭大白兔獲得特異性抗體。用獲得的抗體建立汞的ELISA分析方法。檢測限為0.45μg/L，靈敏度為4.10μg/L。特異性實驗表明，抗體對鎳和銅的交叉反應率分別為10.8%和13.5%，與其他金屬均無明顯交叉反應。本實驗以白芷、胡蘿卜和皮皮蝦為基質，添加回收實驗表明，白芷、胡蘿卜、皮皮蝦回收率均在70%～120%。使用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）驗證方法的準確性，儀器檢測結果和建立的ELISA分析方法具有很好的相關性（相關系數為0.988），表明建立的方法具有很好的準確性。

汞，酶聯免疫，多克隆抗體

Abstract：An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay（IC-ELISA） was developed for the rapid detection of Hg（II）.As the mercury ion was not immunogenic，so mercury was linked to the keyhole limpet hemocyanin（KLH） with 1-（4-isothiocyanobenzyl） ethylenediamine-N，N，N’，N’-tetraacetic acid（ITCBE） as immunogen.For the developed ELISA，the limit of detection and sensitivity were 0.45μg/L and 4.10μg/L，respectively.The cross-reactivity against other metals were all low，except for copper and nickel，which had10.8%，13.5%corss-reactivity，respectively.The recoveries of dahurica，carrot and Pipi shrimp sample were ranging from 70%to 120%.The accuracy of the developed IC-ELISA method was validated by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）.The developed ELISA for dahurica sample showed high correlation with ICP-MS（the correlation coefficients were 0.988）.Thus，it was demonstrated that the established immunoassay for the detection of Hg（II） was reliable.

Key words：mercury；ELISA；polyclonal antibody

汞是自然界存在的在常溫下唯一呈液態的金屬元素，廣泛的應用于生產和生活的各個領域。汞同時也是一種對生物具有很強毒性的金屬元素，會給生態環境和農產品帶來污染，對人類健康造成危害，比如甲基汞在食物鏈中富集，不僅毒害動物，而且影響人的腎、肺、大腦及免疫系統[1-2]。汞污染在世界的某些地區已成為大眾健康的公害[3]。因此，對重金屬汞的檢測就顯得尤為重要。目前常用的重金屬檢測方法主要包括紫外分光光度法（UV）[4]、原子熒光光譜（AFS）法[5]、原子吸收光譜（AAS）法[6]、電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法[7]等。這些方法檢測過程必須在集中大型分析儀器的室內進行，無法用于現場檢測，具有費用高、處理量有限、檢測時間長等缺陷[8]。因此，對于重金屬汞的快速檢測方法的研究一直沒有停止過。國內外對重金屬免疫快速檢測方法已經有一定的研究成果[9]。然而，對于實際應用報道不多。本實驗制備了重金屬汞多克隆抗體、建立了免疫檢測方法和復雜樣品基質的前處理方法，并對汞的免疫檢測方法進行了實際應用研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

汞、鉛、鎘、銀、銅、鉻、鎂、鎳、錳、鐵單元素標準品 中國科學計量研究院；異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE） 日本化學同仁研究所；鑰孔血藍蛋白（KLH）、牛血清蛋白（BSA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、二甲基亞砜（DMSO）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸；N-（2-羥乙基）哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（HEPES） 美國Sigma公司；濃硝酸（優級純）、高氯酸（優級純） 天津市化學試劑一廠；白芷 天津某大藥房；胡蘿卜、皮皮蝦 天津某超市。

超純水儀 美國MILLIPORE公司；酶標儀 美國Thermo公司；蛋白純化儀 美國BIO-RAD公司；電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS） 美國Agilent公司；分析天平-BL610 賽多利斯儀器系統有限公司；高壓消解罐 上海隆拓儀器設備有限公司；紫外分光光度計 日本島津公司；96孔酶標板 丹麥Nunc公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫原和包被原的制備 取ITCBE 1.5mg溶于500μL的DMSO中，將ITCBE溶液緩慢滴加到0.68mL的1.0mg/mL硝酸汞標準溶中，待全部加入后，用三乙胺將反應物pH調到6.0，常溫反應16h后形成ITCBE-Hg螯合物。取10mg KLH溶于pH9.0的HEPES緩沖溶液中，將螯合好的Hg-ITCBE緩慢滴加到蛋白溶液中，室溫反應16h。反應完全后用20mmol/L的pH7.4的HEPES緩沖溶液進行透析，除去多余的小分子即形成KLH-ITCBE-Hg完全抗原。包被原用BSA制備，Hg2+和BSA的偶聯方法與Hg2+和KLH的偶聯方法相同。

1.2.2 標品的制備 由于Hg2+直接與抗體反應可使抗體變性，需要用螯合劑將金屬離子螯合后才能用于檢測[10]。本實驗選用ITCBE作為Hg2+螯合劑。ITCBE和Hg2+螯合方法如下：1mg ITCBE溶于200μL的DMSO中，在磁力攪拌下向其中緩慢滴加455μL的1.0mg/mL的Hg2+標準物質（ITCBE和Hg2+的物質的量比為1∶1），然后用三乙胺調節反應物的pH至中性，室溫攪拌反應16h，即形成標準本品ITCBE-Hg螯合物。

1.2.3 抗體的制備和純化 選用月齡3個月，體重1.5kg左右的新西蘭大白兔作為免疫動物。免疫采用背部皮下多點注射免疫，初次免疫的抗原用等體積弗氏完全佐劑混合乳化，加強免疫的抗原用等體積弗氏不完全佐劑混合乳化[11]。初次免疫后每隔兩周進行一次加強免疫，共進行四次加強免疫。最后一次加強免疫后第10d從兔子股動脈取全血，離心后得到抗血清。采用Protein A-Sepharose 4B作親合層析介質純化抗血清[12]，可獲得特異性抗體。

1.2.4 重金屬汞間接競爭酶聯免疫檢測方法的建立

包被原BSA-ITCBE-Hg用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成1μg/mL，包被在96孔酶標板上，100μL/孔，4℃孵育過夜。PBST洗板3次，每孔加入200μL封閉液（0.5%脫脂乳粉），室溫放置1h。PBST洗板3次，空白孔中每孔加入100μL的PBS，控制孔中每孔加入50μL的PBS和50μL的抗體，其他每孔加入50μL梯度稀釋的汞螯合物標品和50μL的抗體，室溫振蕩孵育1h。PBST洗板3次，加入HRP標記的羊抗兔，每孔100μL，室溫振蕩孵育30min。PBST洗板3次，加入底物液，每孔100μL，37℃顯色10min。加入終止液，每孔50μL。酶標儀讀數。計算不同濃度的汞對抗體與包被原的抑制率I（%）：

以抑制率為縱坐標，汞標樣濃度為橫坐標繪制標準曲線，求出靈敏度（IC50）和最低檢出限（IC15）。

1.2.5 重金屬汞抗體特異性的測定 實驗選擇金屬鎘、鉛、鎳、錳、銅、鉻、鐵、銀、鎂離子進行交叉反應的測定，檢測抗體的特異性。按照建立的汞的間接競爭酶聯免疫檢測方法，用ITCBE螯合其他金屬離子（Cd2+、Pb2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Cr2+、Fe2+、Ag+、Mg2+）代替汞標品，按照所建立的方法進行檢測實驗，計算出其他金屬離子的IC50值，交叉反應率的計算公式為：

交叉反應率（CR，%）=IC50（汞離子）/IC50（其他金屬離子）×100

1.2.6 樣品的處理以及基質影響消除 實驗選擇白芷、胡蘿卜和皮皮蝦為基質，采用濕法硝化[13]處理基質：取一定量白芷、胡蘿卜和皮皮蝦肉干燥至恒重后研磨粉碎，分別準確稱取1.0g樣品，向其中加入5mL硝酸和1mL高氯酸，浸泡過夜，然后使用高壓消解罐在300℃硝化至澄清，排出多余的酸后，調節硝化液pH至6.0，白芷和胡蘿卜用雙蒸水定容到25mL后過0.22μm的水膜可消除基質影響，皮皮蝦用雙蒸水定容到30mL后過0.22um的水膜可消除基質影響。

1.2.7 樣品添加回收 實驗選擇白芷、胡蘿卜、皮皮蝦為基質，按下面的方法進行添加回收實驗。白芷：稱取三份干燥白芷各1.0g，分別添加30、100、350μL的1mg/mL的汞離子，即添加濃度分別為0.03、0.10、0.35mg/g。充分硝化后，調節pH到6.0，加入相同物質的量的螯合劑ITCBE，反應過夜，然后用雙蒸水定容到25mL。按照步驟1.2.4方法進行汞間接競爭酶聯免疫檢測；胡蘿卜的添加檢測方法和白芷相同；皮皮蝦中添加量分別為36、120、420μL的1mg/mL的汞離子，即添加濃度分別為0.036、0.12、0.42mg/g。硝化后用雙蒸水定容到30mL，其他步驟和白芷相同。

1.2.8 方法驗證 實驗選用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）對建立的方法進行驗證。按照步驟1.2.7方法對白芷進行添加，用建立的汞間接競爭酶聯免疫方法和ICP-MS方法進行檢測，對IC-ELISA方法與ICP-MS方法檢測結果進行相關性分析。

2 結果與討論

2.1 重金屬汞抗原、包被原合成

由于Hg2+既沒有免疫原性，也沒有反應原性，為了能夠制備針對汞離子的抗體，必須將汞離子與載體蛋白質連接，形成完全抗原[14]。汞離子與蛋白質直接反應，可使蛋白質變性。因此，我們選擇雙功能螯合劑ITCBE作為汞離子和蛋白質的連接橋[15]。

2.2 標準曲線的建立

圖1 重金屬汞間接競爭ELISA標準曲線Fig.1 Competitive indirect ELISA standard curve of mercury

由于抗體不能直接識別Hg2+，因此需要用螯合劑ITCBE螯合形成ITCBE-Hg螯合物才能進行抗原抗體反應[16]。方法的檢測限定義為：在標準曲線上，抑制率為15%時對應的汞標準品的濃度值，用IC15表示。靈敏度定義為：在標準曲線上，抑制率在50%時對應的汞標準品的濃度值，用IC50表示。由圖1可知，建立的汞間接競爭酶聯免疫方法的檢測限為0.45μg/L，靈敏度為4.1μg/L。

2.3 抗體的特異性

抗體的特異性用交叉反應率來衡量，結果見表1。

表1 汞抗體的交叉反應Table 1 Cross-reactivity of mercury antibody

由表1可知，抗體對鎳和銅的交叉反應率分別為10.8%和13.5%，與其他金屬均無明顯交叉反應，表明抗體的特異性較好。

2.4 樣品的處理

由于樣品中的汞大多數是以結合態存在的，為了檢測樣品中的汞，需要對基質進行預處理。目前主要的處理方法為干法灰化和濕法硝化。由于汞是揮發性元素，不適合用干法硝化[17]，因此采用濕法硝化處理。濕法硝化包括常壓/高壓濕法硝化及常壓/密閉高壓微波硝化。由于密閉高壓濕法硝化處理，具有設備簡單、損失小、效率高的特點[18]，因此選用該法對樣品進行處理。硝化后調節硝化液pH至中性，胡蘿卜硝化后用雙蒸水定容到25mL，過0.22μm的水膜，可以消除基質影響。皮皮蝦硝化后用雙蒸水定容到30mL過0.22μm的水膜，可以消除基質影響，見圖2。

圖2 基質影響消除曲線Fig.2 Matrix influence of samples

2.5 回收率

添加不同水平汞離子，進行添加回收率測定。結果見表2。由表2可知，所有樣品的回收率都在70%～120%，說明建立的方法具有很好的準確性。

在實際樣品檢測中，由于盲樣中汞的濃度是未知的，因此加入的螯合劑ITCBE的量必須是過量的，盲樣中加入的ITCBE的物質的量一般是盲樣中汞殘留限量（國家標準）的5～10倍。

表2 重金屬汞間接競爭ELISA添加回收（n=3）Table2 RecoveryofmercuryfromspikedsamplesbyELISA（n=3）

2.6 相關性分析

ELISA方法和ICP-MS方法檢測白芷中Hg2+結果相關性比較見圖3。兩種方法的線性相關系數R2=0.988。這表明，同一份樣品同時用兩種檢測方法測得的結果一致性很高，進一步證明本實驗所建立的汞間接競爭ELISA檢測結果具有較高的準確性。

圖3 ELISA和ICP-MS檢測結果相關性Fig.3 Comparison of ELISA and ICP-MS for determination of mercury

3 結論

本實驗成功制備了抗汞離子的特異性多克隆抗體，并建立了一種快速有效的檢測重金屬汞離子的間接競爭酶聯免疫（IC-ELISA）方法。樣品經硝化和稀釋即可用于檢測，2.5h即可完成樣品全部檢測過程，檢測效率較高，樣品檢測限低，回收率較高，變異性小。本實驗建立的間接競爭ELISA方法不需要大型儀器設備，與儀器檢測方法相比，具有檢測費用更低，可以同時檢測大量樣品的優點。通過與ICP-MS檢測結果比較，證明該方法檢測結果準確、可靠。

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Development of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Hg（II）

FANG Shu-bing，WANG Jun-ping*，WANG Shuo，ZHANG Yan，SHENG Wei，WANG Jin，YANG Yi-jin
（Key Research Institute of Food Safety Strategy and Management，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

TS207.5+1

A

1002-0306（2012）16-0086-04

2011-12-07 *通訊聯系人

方淑兵（1988-），男，碩士研究生，研究方向：營養與食品衛生學。

“十二五”“863”計劃課題（2012AA101604）。