Escherichia coli K5胞外多糖硫酸酯衍生物的制備及其體外抗氧化活性研究

王 華，徐靜靜，曹 鳳，陳敬華

（江南大學醫藥學院，江蘇無錫 214122）

Escherichia coli K5胞外多糖硫酸酯衍生物的制備及其體外抗氧化活性研究

王 華，徐靜靜，曹 鳳，陳敬華*

（江南大學醫藥學院，江蘇無錫 214122）

對Escherichia coli K5菌株進行發酵培養，發酵液上清經超濾、醇沉、Sevage法脫蛋白、透析凍干，再經DEAE瓊脂糖柱、G75葡聚糖柱分離純化后得到K5多糖（K5）。以三氧化硫吡啶為硫酸酯化劑，對K5多糖N位進行了硫酸酯化，制備了K5多糖的硫酸酯衍生物（NS-K5），二糖分析結果顯示，N位硫酸酯化率達到57%。并對硫酸酯化前后的K5多糖的抗氧化性能進行了研究，結果顯示，一定濃度范圍內，NS-K5多糖還原力較K5高，當K5和NS-K5濃度達到1mg/mL時，對羥基自由基的清除率分別達到17.7%、25.6%，對DPPH自由基的清除率分別達到26.1%、45%。實驗結果表明，NS-K5的抗氧化活性要高于K5。

大腸桿菌K5，胞外多糖，硫酸酯，抗氧化活性

Abstract：Escherichia coli K5 strain was cultivated by fermentation，the supernatant was treated by ultrafiltration，exopolysaccharide（EPS） was extracted by ethanol precipitation，and then purified by Sevage method，dialysis，freeze-dried，DEAE-Sepharose and Sephadex G-75 column，finally high-purity K5 polysaccharide（K5） was obtained.N site of the K5 polysaccharide was chemically sulfated by Sulfur trioxide pyridine complex，NS-K5 polysaccharide（NS-K5） was prepared，and disaccharide analysis revealed that N-sulfation rate was up to 57%.The antioxidant capacity of K5 polysaccharideand N-sulfated K5 polysaccharide was investigated，the results showed that：within a certain concentration range，the reducing activity of NS-K5 was powerful over K5，when the concentration of K5 and NS-K5 was up to 1mg/mL，the hydroxyl radical scavenging rates were 17.7% ，25.6% ，and DPPH radical scavenging rates were 26.1% ，45% ，respectively.The result indicated that NS-K5 showed stronger antioxidant activity than K5.

Key words：Escherichia coli K5；exopolysaccharide；sulfation；antioxidation

自由基的產生與機體的許多疾病和功能障礙，如腫瘤、炎癥、衰老等具有非常密切的關系[1-3]，隨著醫學及生物學的日趨深入發展，對自由基復雜致病機理的研究成為重要的研究課題之一[4]。作為清除自由基的重要物質——抗氧化劑，在食品工業和醫療健康領域的應用由來已久[5]。目前使用的大多為化學合成類抗氧化劑，由于其存在著安全性問題，已經被一些國家禁用或限制使用，人們對于天然來源，低毒甚至無毒的抗氧化劑的需求不斷增加，因此研究開發天然抗氧化劑具有重要的意義。多糖具有抗衰老、免疫調節、抗腫瘤和抗氧化等重要的功能[6]，近年來研究者對天然多糖的抗氧化作用開展了較多的研究[7-8]，不少研究者還對天然多糖進行了硫酸酯化修飾，并對其抗氧化、抗腫瘤、抗菌等生理活性進行了深入的研究，發現其活性與硫酸酯化后的荷電性及分子量密切相關[9-12]。其中微生物來源多糖因為具有易于分離純化、產量高、成本低等眾多優點而受到研究者越來越多的重視[13-15]，但目前國內對于微生物來源多糖及其衍生物的抗氧化研究報道較少。本實驗對Escherichia coli K5菌株進行發酵培養，對其胞外多糖K5進行了N位硫酸化，制備了K5多糖的硫酸酯衍生物，并對其進行了體外抗氧化活性研究，以期為細菌胞外多糖的改性及其食品、藥品功能化的研究開發提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗菌種大腸桿菌E.coli Bi 8337/41（O10：K5：H4） 購自ATCC；無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、溴化鉀、水楊酸、三氯乙酸、三氯化鐵、雙氧水等 均為國產分析純，國藥集團化學試劑有限公司；HeparanaseⅠ、Ⅱ、Ⅲ 蘇州國鏑醫藥科技有限公司；1-二甲基-2-三硝基苯肼（DPPH）、抗壞血酸（VC） 為色譜純，Sigma公司。

紅外光譜儀NICOLET NEXUS 470 Thermo Electron Corporation；UV-1800紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；FreeZone2.5L冷凍干燥機 美國Labconco有限公司；恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；日立高速微量離心機CF15RXII 日本日立儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腸桿菌K5多糖的制備 將大腸桿菌K5菌液接種于10L LB培養基中，轉速為600r/min，pH7.4，37℃培養18h。發酵液8000r/min離心10min分離菌體和上清。發酵液上清經分子量10ku截留的超濾儀超濾濃縮，將濃縮液無水乙醇沉淀，無水乙醇終濃度為80%，4℃靜置過夜，6000r/min離心10min，收集沉淀，去離子水復溶，采用Sevage法脫蛋白，處理12～15次，醇沉，去離子水復溶，透析凍干即為K5粗多糖。經DEAE瓊脂糖柱、G75葡聚糖凝膠柱純化后，透析凍干即得K5多糖，純度為95%。

1.2.2 N位硫酸化K5多糖的制備[16]將K5多糖溶解于2mol/L NaOH中，60℃脫乙酰反應18h，反應結束后冷卻至室溫，用6mol/L HCL調節pH至中性，透析凍干即為N位脫乙酰化的K5多糖。將N位脫乙酰化的K5多糖溶于去離子水，于40℃分四次加入硫酸化試劑三氧化硫吡啶（總投料比為N位脫乙酰化K5多糖∶三氧化硫吡啶=1∶2），間隔為1h，每次加完后用4mol/L NaOH調節pH至9.5，反應36h后，調節pH至中性，透析凍干后即得N位硫酸化的K5多糖。

1.2.3 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的結構表征

1.2.3.1 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的紅外光譜分析 取1mg干燥樣品與150mg溴化鉀混合研磨壓片后，在4000～400cm-1范圍內進行掃描測定。

1.2.3.2 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的二糖分析 去離子水配制濃度為20mg/mL的樣品溶液，取40μL樣品溶液，加入pH7.0乙酸鈉緩沖液140μL及酶混合液（HeparanaseⅠ、Ⅱ、Ⅲ，1∶1∶1）100μL，混勻后于25℃水浴中酶解48h。HPLC分析反應液，記錄峰響應值。

1.2.4 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的抗氧化活性測定

1.2.4.1 清除羥基自由基（·OH）活性的測定[17]用去離子水將各多糖樣品配制成不同的濃度梯度，以VC為對照進行實驗。向1mL樣品溶液中加入6mmol/L的FeSO4溶液1mL，混勻后加入6mmol/L的H2O2溶液1mL，混勻后靜置10min，最后加入6mmol/L的水楊酸溶液1mL，混勻后于37℃水浴中孵育30min，離心（3000r/min，10min），以去離子水為參比，取上清在510nm處測定吸光值。

羥基自由基清除率計算公式為：

式中：E為清除率；Ao為空白對照；AX為樣品溶液的吸光值；AXo為無顯色劑時樣品溶液的吸光值。

1.2.4.2 還原能力的測定[18]用去離子水將各多糖樣品配制成不同的濃度梯度。向2.5mL磷酸鹽緩沖液中加入1mL樣品溶液，再加入2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50℃水浴20min，再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，離心（3000r/min，10min），取上清液2.5mL，加入2.5mL去離子水及0.5mL 0.1%的FeCl3溶液。以去離子水為參比，取上清液在700nm處測定吸光值。

1.2.4.3 清除DPPH·活性的測定[19]用去離子水將各多糖樣品配制成不同的濃度梯度，以VC為對照進行實驗。用無水乙醇配制濃度為0.04mg/mL的DPPH溶液，向2mL DPPH溶液中加入2mL樣品溶液，混勻，靜置30min，離心（3000r/min，10min），取上清液于517nm處測定吸光值。

DPPH自由基清除率計算公式為：

式中：E（DPPH·）：樣品對DPPH·的清除率；Ao：2mL DPPH·溶液+2mL去離子水混勻測定的吸光值；Ai：2mL DPPH·溶液+2mL樣品溶液混勻測定的吸光值；Aj：2mL無水乙醇+2mL樣品溶液混勻測定的吸光值。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜的分析

圖1 K5多糖及NS-K5多糖的紅外圖譜Fig.1 IR spectra of K5 and NS-K5 polysaccharide

K5多糖是一種N位乙酰化的多聚糖胺聚糖，如圖1所示，K5多糖及其硫酸酯衍生物紅外圖譜表現出多糖化合物的特征吸收峰為3418cm-1處的吸收峰是O-H的伸縮振動；2920cm-1處的吸收峰是C-H伸縮振動；1630cm-1處的吸收峰是C=O伸縮振動；1043cm-1處的吸收峰是環內醚C-O-C振動；硫酸酯化后的K5多糖，在1229cm-1處增加了較弱的S=O伸縮振動吸收峰；在801cm-1處增加了較為明顯的N-O-S拉伸振動。通過紅外光譜圖可以看出，通過以上方法成功的在K5多糖N位引入硫酸基。

2.2 二糖組成分析

K5多糖的結構由己糖醛酸-N乙酰氨基葡萄糖的重復單元組成，而NS-K5多糖由己糖醛酸-N硫酸氨基葡萄糖及己糖醛酸-N乙酰氨基葡萄糖的單元組成，本實驗采用特異酶解樣品多糖，能夠深入分析樣品N位硫酸化的狀況。樣品二糖分析結果如圖2和表1所示。

從表1中可以看出，K5多糖的雙糖分析結果顯示較為均一，△UA-GlcNAc雙糖含量達到98.24%。NSK5多糖的二糖分析結果顯示，△UA-GlcNAc雙糖含量僅為11.99%，硫酸酯化修飾過后的△UA-GlcNS雙糖含量達到57%。

圖2 K5多糖及NS-K5多糖的二糖分析圖譜Fig.2 Disaccharide analysis spectra of K5 and NS-K5 polysaccharide

表1 樣品中二糖組成及其含量Table 1 Disaccharide composition and content of samples

2.3 抗氧化分析

2.3.1 清除羥基自由基（·OH）活性 H2O2和Fe2+混合發生Fenton反應，生成具有很高反應活性的·OH，其能被水楊酸有效的捕獲，并生成2，3-二羥基苯甲酸，該羥基化合物在510nm處有特異性吸收，假若在反應體系中加入具有清除作用的活性物質，便會與水楊酸競爭性捕捉·OH，從而使得有色物質生成減少。

圖3 K5、NS-K5多糖及VC對羥基自由基的清除能力的比較Fig.3 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity of K5，NS-K5 polysaccharide and VC

從圖3可以看出，隨著樣品濃度的增加，K5及NSK5多糖對羥基自由基的清除能力在0.05～0.5mg/mL區間內逐步增強，當濃度大于0.5mg/mL時，清除能力隨著樣品濃度的升高逐漸呈現平穩趨勢。NS-K5多糖較K5多糖清除羥基自由基的能力強，較VC弱，當濃度達到1mg/mL時，K5多糖及NS-K5多糖的清除能力分別達到17.7%、25.6%。

2.3.2 還原能力的測定 抗氧化劑是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而去除自由基對機體損害的一類物質，還原能力越強，抗氧化性越強。多糖還原能力的大小一定程度上反映了多糖抗氧化性能的強弱。本實驗中，樣品吸光值越高，多糖還原能力越強。

圖4 K5、NS-K5多糖還原能力的比較Fig.4 Comparison of reducing power of K5 and NS-K5 polysaccharide

從圖4可以看出，隨著多糖濃度的增高，反應后樣品溶液吸光值穩步增高，說明還原力不斷增高，上升趨勢明顯，當多糖濃度為1mg/mL時，K5多糖的吸光值僅為0.051；NS-K5多糖的吸光值為0.12，結果表明NS-K5多糖較K5多糖還原能力強。

2.3.3 清除DPPH·活性的測定 DPPH·是一種很穩定的氮中心的自由基，該法被廣泛用于測定生物試樣的抗氧化能力，其乙醇溶液呈現紫紅色，在517nm處有最大吸光值。抗氧化劑能夠給自由基提供氫原子和單電子而使其褪色，其褪色的程度與抗氧化劑的抗氧化能力成定量關系，試樣吸光度越低，樣品對DPPH自由基的清除率越高，該樣品的抗氧化能力越強。

圖5 K5、NS-K5多糖及VC對DPPH自由基清除能力的比較Fig.5 Comparison of DPPH radical scavenging capacity of K5，NS-K5 polysaccharide and VC

從圖5可以看出，K5、NS-K5多糖及VC都對DPPH自由基呈現出不同程度的清除作用，隨著多糖濃度的增大，其清除作用穩步增高，其中VC的清除作用最強，NS-K5多糖次之，K5多糖對DPPH自由基的清除作用較弱。當多糖濃度低于0.2mg/mL時，K5多糖對DPPH自由基的清除活性比NS-K5多糖略高，但隨著多糖濃度的增大，NS-K5多糖顯示出更強的清除活性，當濃度增加到1mg/mL時，NS-K5多糖對DPPH自由基的清除率達到45%，遠高于K5多糖的清除率26.1%。上述結果表明，NS-K5多糖在一定濃度范圍內對DPPH自由基的清除活性高于K5多糖。

3 結論

本實驗采用三氧化硫吡啶法成功制備了N位硫酸酯化的K5多糖衍生物，經二糖分析K5多糖N位硫酸酯化程度達到57%。抗氧化實驗結果表明，N位硫酸酯化的K5多糖衍生物在一定的濃度范圍內對羥基自由基具有一定的清除作用，顯示出一定的還原力，對DPPH自由基表現出較好的清除活性，其抗氧化活性比同等濃度下的K5多糖高。

微生物來源多糖作為重要的大分子之一，近年來成為國際研究的熱點，其獨特的活性和分子特點在藥物食品研究開發中蘊藏巨大潛力，對于人類健康具有重要意義。本文旨在為微生物來源多糖的研究及開發提供一定的思路和理論基礎。

[1]Harman D.Aging：a theory based on free radical and radiation chemistry[J].J Gerontol，1956，11：298-300.

[2]Fu J，Huang H，Liu J，et al.Tanshinone IIA protects cardiac myocytes against oxidative stress-triggered damage and apoptosis[J].Eur J Pharmacol，2007，568：213-221.

[3]Hu R，Saw CL，Yu R，et al.Regulation of NF-E2-related factor 2 signaling for cancer chemoprevention：antioxidant coupled with anti-inflammatory[J].Antioxid Redox Signal，2010，13（11）：1679-1698.

[4]Finkel T， Holbrook NJ.Oxidants， oxidative stress and the biology of aging[J].Nature，2000，408：239-247.

[5]John WF，Kong AN，Korry JH，et al.Antioxidants in Foods：State of the science important to the food industry[J].J Agric Food Chem，2011，59：6837-6846.

[6]Tzianabos AO.Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents：structural aspects and biologic function[J].Clin Microbiol Rev，2000，13（4）：523-533.

[7]Wang C，Chen Y，Hu ML，et al.In vitro antioxidant activities of the polysaccharides from Tricholoma lobayense[J].Int J Biol Macromol，2012，50（3）：534-539.

[8]Ding X，Hou YL，Hou WR.Structure elucidation and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated from Boletus speciosus Forst[J].Int J Biol Macromol，2012，50（3）：613-618.

[9]Shi BJ， Nie XH， Chen LZ， et al.Anticancer activities of a chemically sulfated polysaccharide obtained from Grifola frondosa and its combination with 5-Fluorouracil against human gastric carcinoma cells[J].Carbohydr Polym，2007，68：687-692.

[10]Jiao G， Yu G， Zhang J， et al.Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae[J].Mar Drugs，2011，9（2）：196-223.

[11]Kim M，Yim JH，Kim SY.In vitro inhibition of influenza a virus infection by marine microalga-derived sulfated polysaccharide p-KG03[J].Antiviral Res，2012，93（2）：253-259.

[12]Johnstone KD，Karoli T， Liu L.Synthesis and biological evaluation of polysulfated oligosaccharide glycosides as inhibitors of angiogenesis and tumor growth[J].J Med Chem，2010，3（4）：1686-1699.

[13]Maura JM，Tanenbaum SW，Nakas JP.Optimization of novel extracellular polysaccharide production by an enterobacter sp，on wood hydrolysates[J].Appl Environ Microbiol，1994，60（4）：1367-1369.

[14]Elena L，Israel R，Anzeles SM.Extracellular polysaccharides production by Arthrobaeter viscosus[J].J Food Eng，2003，60：463-467.

[15]Wang ZY，Jonathan SD，Robert JL.Escherichia coli K5 heparosan fermentation and improvement by genetic engineering[J].Bioeng Bugs，2011，2（1）：63-67.

[16]Daria L，Mirella B，Chiara U，et al.Fibroblast growth factor-2 antagonistactivity and angiostatic capacity ofsulfated Escherichia coli K5 polysaccharide derivatives[J].J Biol Chem，2001，276：37900-37908.

[17]徐春蘭，欽傳光，牛衛寧，等.Enterobacter cloacae Z0206細菌胞外多糖的體外抗氧化活性研究[J].天然產物研究與開發，2010，22（6）：1098-1102.

[18]劉莎，葉淑紅，王際輝，等.一株細菌ps-5胞外多糖抗氧化性能研究[J].食品科技，2010，35（6）：111-114.

[19]Amarowicz R，Naczk M，Shahidi E.Antioxidant activity of various fractions of nontanin phenolics of canola hulls[J].J Agric Food Chem，2000，48：2755-2759.

Preparation and antioxidant activities of a sulfated derivative of exopolysaccharide from Escherichia coli K5

WANG Hua，XU Jing-jing，CAO Feng，CHEN Jing-hua*
（School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0118-04

2012-03-01 *通訊聯系人

王華（1986-），男，碩士研究生，研究方向：多糖生物學研究。

國家自然科學基金（50873080）；教育部新世紀優秀人才計劃（NCET-10-0435）。