雙酶處理對玉米淀粉鏈結構和消化性的影響

熊珊珊，繆 銘，江 波，*

（1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122）

雙酶處理對玉米淀粉鏈結構和消化性的影響

熊珊珊1，2，繆 銘1，江 波1，*

（1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122）

研究雙酶處理形成慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）的精細結構。采用兩種酶（β-淀粉酶的水解作用和轉苷酶的轉苷作用）對玉米淀粉進行雙重處理以期提高慢消化淀粉含量。實驗結果發現，經過β-淀粉酶水解后的玉米淀粉再經轉苷酶處理，其鏈長分布、碘吸附作用和消化性能有了顯著地變化，并且這種變化隨不同的轉苷處理時間而有明顯差異。原淀粉經過β-淀粉酶處理4h，再經過轉苷酶處理24h后的淀粉樣品SDS最高含量可以達到13.95%，此時的樣品平均鏈長為12.58，分支密度為7.95%。實驗證明酶法改性淀粉可以有效改善淀粉的消化性能。

消化性，鏈長，分支密度，玉米淀粉

Abstract：Fine structure of slowly digestible starch（SDS） formed during dual-enzymes treatment was investigated.Through the hydrolysis of β-amylase and transglycosylation of transglucosidase，higher amount of SDS could be obtained.The result indicated that the chain length distribution，iodine binding and digestibility of starch samples，which were subjected to different time of transglycosylation following β-hydrolysis，changed obviously.After maize starch being treated by β-amylase for 4h，the highest SDS amount of 13.95%was gained when transglucosidase continued to treat for 24h，the average chain length was 12.58，and branch density was 7.95%.The experiment proved that dual-enzymes treatment could improve the digestibility of maize starch effectively.

Key words：digestibility；chain length；branch density；maize starch

淀粉屬于多聚葡萄糖，其分子式通常表示為（C6H10O5）n，n為不定數，可以聚合度DP（degree of polymerization）來表示。淀粉是由直鏈狀和支叉狀兩種分子組成的，脫水葡萄糖單位間經α-1，4糖苷鍵連接，稱為直鏈淀粉（amylose）；交叉位置是α-1，6糖苷鍵連接，其余為α-1，4糖苷鍵連接，稱為支鏈淀粉（amylopectin）。由于淀粉是人類膳食中主要的碳水化合物，也是人體能量的主要來源，淀粉消化的方式和速度對人體餐后血糖應答有著很重要的影響[1-2]，因此改善淀粉的消化利用有著非常大的研究前景。1992年，英國學者Englyst[3]等提出在體外模擬的條件下依據淀粉的生物可利用性將淀粉分為三類：易消化淀粉（ready digestible starch，RDS），指那些能在口腔和小腸中被迅速消化吸收的淀粉（＜20min），屬于快速釋放能量的高血糖食品；慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS），指那些能在小腸中被完全消化吸收但速度較慢的淀粉（20～120min），可持續緩慢釋放能量，維持餐后血糖穩態；抗性淀粉（resistant starch，RS），指在人體小腸內無法消化吸收的淀粉（＞120min），類似于膳食纖維只能在大腸中被微生物發酵利用。Ao[4]等通過不完全水解淀粉，將支鏈淀粉側鏈（A鏈與B鏈）和直鏈淀粉的長度變短，從而使淀粉的分支密度增加，研究此鏈結構變化與和淀粉的消化速率之間的關系，發現淀粉的精細結構對淀粉的消化影響很大，而淀粉分支密度的增加和酶處理淀粉的晶體結構與淀粉的慢消化性有密切關系。β-淀粉酶作為淀粉水解酶，能切斷α-1，4糖苷鍵，順次得到麥芽糖單位，但不能裂開支鏈淀粉中的α-1，6糖苷鍵，而轉葡糖苷酶（transglucosidase，EC 2.4.1.24）不僅可以催化低聚麥芽糖的水解而且可以催化它的轉移反應[5]。之前的研究發現β-淀粉酶在水解4h后得到的SDS含量1.83%，為了得到更大的SDS含量，繼續利用轉苷酶對該樣品進行處理，通過對處理后樣品的精細結構與消化性能進行分析探討，證明淀粉微觀結構影響淀粉的消化性能，為酶法修飾重組慢消化淀粉提供充分的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

普通玉米淀粉 直鏈淀粉含量為24.6%，河北燕南食品集團有限公司；豬胰α-淀粉酶（A3176） 美國Sigma公司；大麥β-淀粉酶、轉苷酶L-500 無錫杰能科生物工程有限公司；異淀粉酶、葡萄糖試劑盒（GOD-POD） 愛爾蘭Megazyme公司；纖維素酯微孔膜 0.45μm，海寧市正方過濾設備器材廠；乙酸鈉、碘化鉀、碘、無水乙醇、無水乙酸等 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

恒溫振蕩水浴鍋 太倉華利達實驗室設備公司；5804 R離心機 德國Eppendorf公司；Delta 320臺式pH計 瑞士Mettler Toledo公司；ICS-5000離子色譜儀 美國戴安公司；UNICO UV-2012PC型紫外可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 淀粉的β-淀粉酶處理 稱取8g淀粉，加入92mL去離子水，在95℃水浴下充分振蕩20min，冷卻至室溫，再加入0.5mol/L乙酸鈉緩沖液（pH5.2）至180mL，加入5.12μL β-淀粉酶，于55℃水浴中振蕩4h后，沸水浴5min滅酶，取18mL反應液，剩余樣品冷卻后加入2倍體積的無水乙醇，靜置，于3000r/min離心10min，將沉淀冷凍干燥，得到淀粉樣品簡稱為BS。

1.2.2 淀粉的轉苷酶處理 向1.2.1中取出的18mL滅酶過的反應液中，加入20mL 0.1mol/L乙酸鈉緩沖液（pH4.5），混勻后于95℃水浴振蕩20min，冷卻至室溫后，然后加入0.8mL轉苷酶（1U/mL），置于50℃恒溫水浴中振蕩反應12h，加入2倍體積的無水乙醇，靜置，于3000r/min離心10min，將沉淀冷凍干燥。

分別重復1.2.1過程取18mL滅酶過反應液，再依照上述相同條件用轉苷酶另處理24、36h，加入2倍體積的無水乙醇，靜置，于3000r/min離心10min，將沉淀冷凍干燥。

總共得到三種淀粉樣品分別簡稱為BT1、BT2、BT3。

1.2.3 用Englyst法測定消化性能 取3g豬胰α-淀粉酶加入10mL 0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液（pH5.2），在燒杯中溶解后4℃離心，取上清液加入1mL糖化酶，混酶配制完成。

稱取淀粉樣品300mg，加入三角瓶中，添加7.5mL pH5.2的0.5mol/L乙酸鈉緩沖液，混勻后在95℃水浴振蕩處理20min，冷卻至室溫后再置于37℃恒溫水浴中，待溫度平衡后加入0.75mL混酶液，開始振蕩反應（轉速為150r/min）并準確計時。水解20、120min后，分別取出0.5mL水解液加入20mL 66%乙醇滅酶[3]，靜置，離心，然后離心處理后的上清液用葡萄糖試劑盒中的葡萄糖氧化酶（GOPOD）法在510nm波長處測定產生的葡萄糖含量。具體計算公式如下：

式中：m20為淀粉酶水解20min后產生的葡萄糖質量，mg；mFG為酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖質量，mg；m120為淀粉酶水解120min后產生的葡萄糖質量，mg；mTS為樣品中總淀粉質量，mg；RDS為慢消化淀粉；SDS為快消化淀粉；RS為抗性淀粉。

1.2.4 淀粉樣品的碘吸附及波長掃描 稱取2g碘化鉀，溶解至100mL pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，然后加入0.2g碘，溶解后低溫避光保存。

取0.08g淀粉樣品，加入到20mL二甲亞砜中，加熱使樣品充分溶解，從中取1mL樣品溶液至100mL去離子水中，混勻后取出0.8mL，再加入20μL碘液，充分混勻后立即倒入比色皿內，在可見光500～800nm的范圍內進行波長掃描，得到掃描圖形和數據。

1.2.5 淀粉樣品的鏈長分布 參照繆銘[6]等對淀粉的預處理方法，稱取淀粉樣品10mg，加入0.9mL蒸餾水，充分振蕩，95℃水浴加熱15min，然后冷卻至室溫，再加入2.5mL 0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液（pH4.0），放置于40℃水浴鍋中，待溫度平衡后，加入5μL異淀粉酶（1000U/mL），于40℃保溫振蕩24h后，立即取出脫支處理后的樣品并沸水浴滅酶。

將得到的樣品在10000r/min離心10min，取上清液并稀釋，然后用0.45μm的纖維素酯微孔膜過濾，得到的濾液進行離子色譜分析，參照CHANG等人[7]的高效陰離子交換色譜（High performance anion exchange chromatography，HPAEC）分析方法，使用CarboPac PA 200色譜柱分離脫支樣品。先用250mmol/L氫氧化鈉溶液平衡色譜柱，然后用1mol/L乙酸鈉溶液和100mmol/L氫氧化鈉溶液以0.5mL/min的流速做樣品洗脫液。分析后得到不同聚合度的峰型圖。

1.2.6 計算鏈長分布比例和分支密度 根據HPAEC結果得到的各個DP值峰面積，計算出各鏈長分布的比例、平均鏈長和淀粉的分支密度[8]。

2 結果與討論

2.1 淀粉樣品的消化性能

從表1可以看出，β-淀粉酶和轉苷酶的處理使得淀粉樣品的RDS含量得到降低，說明SDS含量和RS總含量有所提高，得到樣品的消化性能有所改善。糊化淀粉的SDS含量僅為0.35%，經過β-淀粉酶水解處理后的BS樣品SDS含量達到了1.83%，再經過轉苷酶處理12、24、36h后的BT1、BT2、BT3樣品整體SDS含量都有了更明顯地提高，這一結論與Ao等人[4]用β-淀粉酶和轉苷酶處理玉米淀粉后的SDS含量增加的結果相符，說明雙酶處理有助于有效改善淀粉消化性質。而且轉苷酶酶處理時間長短也影響著淀粉SDS含量，其中BT2樣品得到了13.95%的SDS含量，BT3樣品的SDS含量為13.5%，略低于BT2，足夠的轉苷作用可以達到提高SDS的目的，然而當轉苷時間過長，會有小幅度的下降。另外，BT1、BT2、BT3樣品在轉苷作用后，RS含量反而下降。

表1 β-淀粉酶、轉苷酶處理的淀粉樣品消化性能Table 1 Digestibility of starch treated by β-amylase and transglucosidase

由于淀粉的分支密度和結晶結構是形成SDS的重要因素，通過部分縮短支鏈淀粉外鏈和直鏈淀粉的長度形成高密度的分支鏈，增加淀粉的分支密度能改變其慢消化性能[9]。根據以上結果推測，BS樣品再經過轉苷酶的糖苷轉移作用，結構又有了新的變化，轉苷酶的轉苷作用使淀粉產生了更多的分支糖苷鍵，形成了類似于簇狀的分支結構，減緩了消化速率。

2.2 淀粉-碘吸附結合物

碘液與淀粉顯色原理是碘分子可以鉆入支鏈淀粉螺旋空隙當中，并借助范德華力與直鏈淀粉聯系在一起，從而形成絡合物。這種絡合物能比較均勻地吸收除藍光以外的其他可見光，從而使淀粉變為深藍色，并且最大峰出現的波長越小，淀粉的鏈越短，所以淀粉-碘吸附曲線可以在一定程度上反映出淀粉的內部鏈結構。

從圖1可以看出，其中未經過轉苷酶處理的BS樣品在4個樣品中吸光度值最高。顯然，經過轉苷酶處理后的吸光度值下降了很多，而且最大吸收波長向低值偏移。BT1、BT2、BT3樣品的三條波段吸收曲線變化趨勢是基本一致的，都在550～575nm出現了最大吸收峰，但三者的吸光度值和最大吸收波長都略有不同：BT1、BT2、BT3的吸光度值依次下降，即轉苷酶處理時間越長，吸光度值越小；但最大吸收峰的波長偏移則不同，BT2樣品最大吸收波長最小，BT1樣品最大吸收波長最大，BT3則居中。

圖1 淀粉-碘吸附結合物的可見光吸收曲線Fig.1 Wavelength scanning profiles of starch samples binding iodine

圖1表明轉苷酶的處理時間長短會影響淀粉碘吸附能力的大小。轉苷酶對BS樣品的作用中發生了結構的改變，轉苷作用從長分支鏈切下葡聚糖，然后轉移形成更多的分支，所以平均鏈長變短。Xinyu[10]對β-淀粉酶水解的淀粉進行碘吸附，得出淀粉鏈長的縮短會減弱碘分子的吸附能力的結論，解釋了BT1、BT2、BT3樣品在圖1中表現出比BS樣品小很多的吸光度值，而且最大吸收峰明顯的往短波長方向偏移，不同處理的時間導致了不同程度的偏移，而這種偏移程度與各自SDS含量的變化是一致的。

2.3 淀粉樣品的分支鏈長分布

圖2 BS、BT1、BT2、BT3分別經過HPAEC得到的色譜圖Fig.2 Chromatograms of BS，BT1，BT2，BT3after HPAEC

表2 淀粉樣品的不同鏈長部分的面積Table 2 Chain length distribution of starch samples

HPAEC分析得到淀粉分支鏈長分布，通過其中各個峰的大小可以看出不同聚合度（DP）的鏈長所占的比例。從表2中的各樣品鏈長分布的變化可以發現，經過不同時間轉苷酶處理淀粉的長鏈與短鏈分配的比率存在明顯的差異，在BS淀粉樣品中含有較多中短鏈（FrⅡ+FrⅢ），轉苷酶處理過后的淀粉含有的大部分是短鏈（FrⅢ）。通常將淀粉分支側鏈分為A、B、C三種鏈，鏈的末端都具有一個非還原末端。其中，A鏈是外鏈，經由α-1，6糖苷鍵與B鏈連接，B鏈又經由α-1，6糖苷鍵與C鏈連接，A鏈與B鏈的數目大體相等，C鏈是主鏈，每個支鏈淀粉只有1個C鏈。B鏈依據側鏈各自的長度和跨越的簇的數量，可進一步被分為B1、B2、B3等鏈。一般來說，A鏈的聚合度（DP）小于13（最短鏈），B1鏈的DP為13～30，B2鏈的DP為31～50，而B3則更長些[11-12]。因此可以推斷出所有樣品都含有高比例的A鏈，其次是B1鏈，B2、B3鏈含量都很低，除此之外，轉苷酶處理時間越長，短鏈（FrⅢ）增加的越多，中長鏈（FrⅠ+FrⅡ）則相應的減少。

2.4 淀粉樣品的平均鏈長和分支密度

表3 淀粉樣品的平均鏈長和分支密度Table 3 Average chain length and branch density of starch samples

由表3可以看出，BT3樣品即轉苷酶處理36h得到樣品的平均鏈長為11.23，在所有樣品中為最小，而BS樣品的平均鏈長最大。由此發現，經過轉苷酶處理后的樣品，鏈長在不斷下降，而且酶處理時間越久，相對應的樣品平均鏈長越小。另外，相比于BS樣品，BT1、BT2、BT3三個樣品的分支密度都有提高，且隨轉苷酶處理時間越長分支密度則越高。以上結果說明轉苷酶的處理有效改變了淀粉分子的內部鏈結構。

將表3的平均鏈長和分支密度同表1中各樣品的SDS含量對照，發現樣品中分支密度最高的BT3樣品，平均鏈長最短為11.23，但其相對應SDS含量為13.50%，略低于BT2樣品中13.95%的慢消化淀粉含量。由此可說明，樣品的分支密度越大，相對應SDS含量不一定越高，它們之間不是呈正比關系，分支密度過高和過低都有可能會出現SDS含量下降，只有將樣品的分支密度提高，平均鏈長下降至一定程度，才能得到最大的SDS含量，這與Zhang[13]等報道分支外鏈在一定DP值范圍內的SDS含量最高的結論相一致。

綜上所述，由表1和表3可以充分驗證，SDS含量的變化確實和淀粉的內部結構有很大的關系，更準確地說是淀粉鏈結構的平均長度和分支密度影響了SDS含量，而且正是酶對淀粉的處理才使得淀粉的內部結構發生了變化。當酶的催化糖苷轉移作用充分改變了淀粉鏈長，平均鏈長變短，分支度增加后，淀粉酶、糖化酶在消化淀粉的時候，受到多分支結構的阻力，減緩了消化速度。如果轉苷作用導致淀粉鏈長過短，消化酶很容易接觸到分支鍵，淀粉會被快速消化成還原糖。

3 結論

雙酶處理對淀粉分子的鏈結構以及其消化性質產生的影響表明，短鏈不利于結合更多的碘分子，并且可見光吸收的最大吸收波長與淀粉樣品SDS含量存在關系；分支密度影響著SDS含量的高低，有效提高SDS含量的方法就是形成多分支短鏈的簇型結構。所以本實驗證明，酶法修飾淀粉可以達到重組淀粉結構，從而改善淀粉消化性能的目的，在食品工業生產中具有廣闊前景。

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Effect of dual-enzymes treatment on chain structure and digestibility of maize starch

XIONG Shan-shan1，2，MIAO Ming1，JIANG Bo1，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS231

A

1002-0306（2012）16-0127-04

2012-01-16 *通訊聯系人

熊珊珊（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品加工新技術。

國家自然科學基金項目（20976073，31000764）；江蘇省科技支撐項目（BE2010717）；中央高校基本科研業務費專項資金（JUSRP10930）。