檸檬汁清除DPPH自由基能力及實驗方法比較研究

周 玥，張 娜，林太鳳，鐘儒剛

（北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124）

檸檬汁清除DPPH自由基能力及實驗方法比較研究

周 玥，張 娜*，林太鳳，鐘儒剛

（北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124）

應(yīng)用電子順磁共振（EPR）和紫外-可見分光光度計（UV-Vis）兩種方法研究美國加州和中國廣西檸檬汁清除DPPH自由基的能力。結(jié)果表明，EPR方法測得加州和廣西檸檬汁的半數(shù)清除率EC50值分別為54.53%和32.73%；UV-Vis方法測得加州和廣西檸檬汁的EC50值分別為46.41%和30.41%，并且DPPH自由基清除率與檸檬汁濃度呈現(xiàn)良好的正相關(guān)性。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明，兩種實驗方法的實驗結(jié)果之間無顯著性差異，測試方法對實驗結(jié)果無顯著性影響，兩種方法均可用于檸檬汁對DPPH自由基清除能力的研究。

電子順磁共振，紫外可見分光光度計，檸檬汁，DPPH自由基

Abstract：The DPPH radical scavenging capacities of California lemon juice and Guangxi lemon juice were determined using electron paramagnetic resonance（EPR） and ultraviolet-visible spectroscopy（UV-Vis）.The EC50values for California and Guangxi lemon juice measured by EPR method were 54.53%and 32.73%，respectively，and the corresponding vales measured by UV-Vis method were 46.41%and 30.41%，respectively.The study revealed good positive correlation between DPPH radical scavenging rate and lemon juice concentration.In addition，statistical analysis indicated that the results were not significantly influenced by methods.In conclusion，both the two methods could be used for analysis of DPPH radical scavenging capacities of lemon juice.

Key words：electron paramagnetic resonance；ultraviolet-visible spectroscopy；lemon juice；DPPH radical

自由基是人體新陳代謝時產(chǎn)生的一系列活性分子，可與蛋白質(zhì)、核酸作用導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官的損傷，進(jìn)而誘發(fā)多種疾病，如癌癥、心血管功能障礙等[1-2]。因此具有低毒、高效自由基清除能力的天然抗氧化劑引起了國內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注[3]。檸檬屬于蕓香科柑橘屬檸檬，富含類黃酮、維生素C、類胡蘿卜素等多種抗氧化活性成分[4-7]，是一種極具開發(fā)潛力的天然抗氧化劑。DPPH（2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基）是一種穩(wěn)定存在的有機(jī)氮自由基，廣泛應(yīng)用于體外抗氧化劑能力研究[8-9]。目前測定抗氧化劑清除DPPH自由基能力的主要方法是紫外-可見分光光度計法，隨著相關(guān)技術(shù)的成熟，EPR法開始逐漸應(yīng)用于此領(lǐng)域。電子順磁共振（EPR）是一項直接檢測含有未成對電子物質(zhì)的光譜技術(shù)，該方法基于DPPH自由基在3500G左右具有特征峰，信號強(qiáng)度與抗氧化劑濃度及反應(yīng)時間成反比的原理進(jìn)行測定[10-11]。紫外-可見分光光度計法（UV-Vis）基于DPPH在515nm左右有特征吸收峰，抗氧化劑提供氫原子將DPPH上的單電子還原使其顏色減弱，據(jù)其吸光值的減少量來評價自由基的清除程度[8，12]。目前，關(guān)于檸檬的研究多集中于果皮、果肉中活性物質(zhì)的分離及提純等方面[4，7]，而對其清除自由基能力的研究鮮有報道。本文采用電子順磁共振和紫外可見分光光度計兩種方法研究美國加州和中國廣西檸檬汁清除DPPH自由基的能力，以探究檸檬的抗氧化性能，為其作為抗氧化劑的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

國產(chǎn)檸檬 產(chǎn)地中國廣西；進(jìn)口檸檬 產(chǎn)地美國加州；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH） 美國Sigma公司；無水甲醇 一級色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司。

A-300電子順磁共振儀 德國Bruker公司；UV-3010紫外可見分光光度計 日本HITACHI公司；5810R臺式高速大容量離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檸檬汁的制備 制備參考馮翠萍的方法[13]并略作改動。選取新鮮檸檬，洗凈、切塊、榨汁并過濾。濾液經(jīng)11000r/min離心取上清液制得檸檬汁。使用無水甲醇稀釋果汁，配制體積百分比濃度（V/V）為10%、20%、40%、60%、80%的檸檬汁溶液，冷藏保存。

1.2.2 DPPH溶液的配制 儲備液配制：準(zhǔn)確稱取DPPH固體粉末0.0710g，用無水甲醇溶解并定容于100mL容量瓶，配制成1.80mmol/L DPPH儲備液，冷藏避光保存。使用液配制：準(zhǔn)確移取5mL儲備液于50mL容量瓶，用無水甲醇定容至刻度，配制成0.180mmol/L DPPH使用液，使用液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 EPR參數(shù)設(shè)定 中心磁場 3524.970G；掃場寬度200.000G；微波頻率9.842GHz；微波功率20.17mW；調(diào)制頻率100kHz；調(diào)制幅度2.00G。

1.2.4 EPR法測定檸檬汁對DPPH自由基的清除能力 取不同濃度的加州和廣西檸檬汁，按照表1進(jìn)行加樣，反應(yīng)30min后用50μL毛細(xì)管吸取一定量反應(yīng)混合液裝入保護(hù)管，置于諧振腔中進(jìn)行測試。以譜圖中3507G處峰高表示DPPH自由基的強(qiáng)度，按式（1）計算檸檬汁對DPPH自由基的清除率。

式中：I1：未加檸檬汁時DPPH原始信號強(qiáng)度，使用無水甲醇代替樣品液；I2：加入檸檬汁后DPPH的信號強(qiáng)度。

表1 EPR實驗加樣表Table 1 Sample composition for EPR experiment

1.2.5 UV-Vis法測定檸檬汁對DPPH自由基的清除能力 取不同濃度的加州和廣西檸檬汁，按照表2進(jìn)行加樣，反應(yīng)時間為30min，采用1cm比色皿測定混合液在514nm處的吸光值（Abs）。按式（2）計算檸檬汁對DPPH自由基的清除率。

式中：A1：未加檸檬汁時DPPH原始吸光值，使用無水甲醇代替樣品液；A2：檸檬汁與無水甲醇混合液的背景吸光值；A3：加入檸檬汁后DPPH的吸光值。

表2 UV-Vis實驗加樣表Table 2 Sample composition for UV-Vis experiment

1.2.6 實驗數(shù)據(jù)分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件對兩種方法測定同一樣品的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析[14]。在顯著性水平α=0.05的條件下，先進(jìn)行Levene檢驗以確定方差齊性，再進(jìn)行方差分析以探討該兩組數(shù)據(jù)之間是否存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPR法測定檸檬汁對DPPH自由基的清除能力

分別選取6種濃度的加州和廣西檸檬汁進(jìn)行測試，以磁場強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，信號強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制檸檬汁清除DPPH自由基的電子順磁共振波譜圖，如圖1所示。

圖1 加州（a）和廣西（b）檸檬汁清除DPPH自由基的電子順磁共振波譜圖Fig.1 EPR signals of DPPH radicals in the presence of California（a）and Guangxi（b）lemon juice

由圖1可知，DPPH自由基特征峰中心磁場均在3507G，自由基波譜信號強(qiáng)度均隨檸檬汁濃度的增加而顯著減小，說明檸檬汁的濃度越大，對DPPH自由基的清除作用越強(qiáng)。進(jìn)一步分析可知，加州檸檬汁隨濃度的增大，自由基信號減弱趨勢較為平穩(wěn)；而廣西檸檬汁在濃度60%時，自由基信號強(qiáng)度銳減并趨于零，說明兩種檸檬汁對DPPH自由基的清除能力存在差異。

實驗中每種濃度進(jìn)行三組平行實驗，根據(jù)式（1）計算清除率并取平均值，以DPPH自由基清除率（%）對檸檬汁體積百分比濃度（%）作圖，見圖2。

圖2 加州（a）和廣西（b）、（c）檸檬汁DPPH自由基清除能力與濃度的關(guān)系Fig.2 The correlation between DPPH radical scavenging rate and lemon juice concentration of California（a）and Guangxi（b），（c）

由圖2可知，在一定濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率隨檸檬汁濃度增加而逐漸升高。濃度為60%的廣西檸檬汁與濃度100%的加州檸檬汁自由基清除效果相當(dāng)，且清除率接近100%。進(jìn)一步分析可知，加州和廣西檸檬汁分別在0～100%和0～60%濃度范圍內(nèi)，自由基清除率與濃度之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。通過計算得出：加州和廣西檸檬汁清除DPPH自由基的半數(shù)清除率EC50值（DPPH比起始強(qiáng)度減少50%時所對應(yīng)的清除劑濃度）分別為54.53%和32.73%。說明此實驗中測定的廣西檸檬汁對DPPH自由基的清除能力優(yōu)于加州檸檬汁。

2.2 UV-Vis法測定檸檬汁對DPPH自由基的清除能力

圖3為DPPH自由基溶液及加入檸檬汁溶液后的紫外-可見分光光譜圖。從圖3中可以看出，DPPH溶液在326nm和514nm處有特征吸收峰，加入濃度為40%和100%的檸檬汁后，514nm處吸收峰明顯下降，且檸檬汁在此處無特征吸收峰，故選擇514nm為本實驗的檢測波長。

圖3 DPPH自由基溶液的紫外-可見光譜圖Fig.3 UV-Vis signals of DPPH radicals

實驗對6組不同濃度的加州和廣西檸檬汁分別進(jìn)行測試，每種濃度進(jìn)行三組平行實驗，根據(jù)式（2）計算清除率并取平均值，得到不同體積百分比濃度檸檬汁對DPPH自由基清除率的量效關(guān)系，見圖4。

圖4 加州（a）和廣西（b）、（c）檸檬汁DPPH自由基清除能力與濃度的關(guān)系Fig.4 The correlation between DPPH radical scavenging rate and lemon juice concentration of California（a）and Guangxi lemon（b），（c）

結(jié)合圖3～圖4可以看出：檸檬汁對DPPH自由基的清除率隨濃度的變化趨勢與紫外譜圖中一致。60%濃度的廣西檸檬汁自由基清除率接近100%與濃度為100%的加州檸檬汁清除程度相當(dāng)。進(jìn)一步分析可知，對于加州和廣西檸檬汁，其自由基清除率與濃度呈現(xiàn)較好線性關(guān)系的濃度范圍分別是0～100%和0～60%，與EPR法的實驗結(jié)果一致。加州和廣西檸檬汁清除DPPH自由基的EC50值分別為46.41%和30.41%。說明此實驗中所測定的廣西檸檬汁對DPPH自由基的清除能力優(yōu)于加州檸檬汁。由此可見，EPR法和UV-Vis法在檸檬汁清除DPPH自由基能力的測定上具有可比性。

2.3 實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析

為了探討方法因素對實驗數(shù)據(jù)有無顯著性影響，采用SPSS軟件對EPR法和UV-Vis法測定同一樣本（加州或廣西檸檬汁）的兩組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表3所示。方差齊性Levene檢驗結(jié)果表明，加州和廣西檸檬汁顯著性指標(biāo)p值分別為0.206和0.785，均大于顯著水平0.05，說明兩種方法測試同一樣本的兩組實驗結(jié)果方差齊性，可進(jìn)行方差分析。方差分析結(jié)果表明，加州和廣西檸檬汁的F值分別為0.660和0.070，均小于統(tǒng)計分布F分布數(shù)值表中的F0.025（17，17）值2.673[15]，同時加州和廣西檸檬汁的顯著性指標(biāo)p值分別為0.442和0.793，均大于顯著水平0.05，說明兩種方法測試同一樣本的實驗結(jié)果之間無顯著性差異，即檸檬汁對DPPH自由基清除率受方法因素的影響不顯著，兩種方法均可用于檸檬汁對DPPH自由基清除能力的研究。

表3 單因素方差分析Table 3 One factor analysis of variance

已有文獻(xiàn)報道，檸檬汁中富含的類黃酮及抗壞血酸具有很強(qiáng)的抗氧化作用[6，16]，其中類黃酮化合物主要以類黃酮糖苷形式存在，通過向自由基提供氫原子或與其形成芳氧基基團(tuán)而達(dá)到清除自由基的目的[2，17]。總抗壞血酸是重要的水溶性抗氧化劑，具有很好的生物利用性，分為L-抗壞血酸和和L-脫氫抗壞血酸兩種形式，檸檬汁中主要以L-抗壞血酸的形式存在，向自由基提供氫原子使之失活，自身轉(zhuǎn)變?yōu)長-脫氫抗壞血酸[6，18]。本實驗中，DPPH是一種穩(wěn)定的深紫色有機(jī)氮自由基，加入檸檬汁后生成淺黃色的2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼，致使自由基信號減弱。由上述實驗可知，加州和廣西檸檬汁均對DPPH自由基具有較好的清除能力。

3 結(jié)論

運用電子順磁共振和紫外可見分光光度計兩種方法分別對加州和廣西檸檬汁清除DPPH自由基的能力進(jìn)行測定。實驗結(jié)果表明，加州和廣西檸檬汁均對DPPH自由基具有較好的清除能力，且清除率與果汁濃度成正相關(guān)性，在此實驗中所測定的廣西檸檬汁對DPPH自由基的清除能力優(yōu)于加州檸檬汁。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明，兩種方法測試同一樣本的實驗結(jié)果之間無顯著性差異，即方法因素對測試結(jié)果無顯著性影響，兩種方法均可用于檸檬汁對DPPH自由基清除能力的研究。

[1]Fearon I M，F(xiàn)aux S P.Oxidative stress and cardiovascular disease：Novel tools give（free） radical insight[J].Journal of molecular and cellular cardiology，2009，47（3）：372-381.

[2]Benavente-García O， Castillo J， Marin F R， et al.Uses and Properties of Citrus Flavonoids[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45（12）：4505-4515.

[3]Brewer M S.Natural antioxidants：Sources，compounds，mechanisms of action，and potential applications[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2011，10（4）：221-247.

[4]Ramful D，Bahorun T，Bourdon E，et al.Bioactive phenolics and antioxidant propensity of flavedo extracts of Mauritian citrus fruits：Potential prophylactic ingredients for functional foods application[J].Toxicology，2010，278（1）：75-87.

[5]Di Vaio C，Graziani G，Gaspari A，et al.Essential oils content and antioxidant properties of peel ethanol extract in 18 lemon cultivars[J].Scientia Horticulturae，2010，126（1）：50-55.

[6]Gonzalez-Molina E，Dominguez-Perles R，Moreno D A，et al.Natural bioactive compounds of Citrus limon for food and health[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis，2010，51（2）：327-345.

[7]Wang Y，Chuang Y，Ku Y.Quantitation of bioactive compounds in citrus fruits cultivated in Taiwan[J].Food Chemistry，2007，102（4）：1163-1171.

[8]Singh S，Singh R P.In vitro methods of assay of antioxidants：An overview[J].Food reviews international，2008，24（4）：392-415.

[9]Karadag A， Ozcelik B， Saner S.Review of Methods to Determine Antioxidant Capacities[J].Food Analytical Methods，2009，2（1）：41-60.

[10]Lucy Yu L，Cheng Z.Application of electron spin resonance（ESR） spectrometry in nutraceutical and food research[J].Molecular Nutrition&Food Research，2008，52（1）：62-78.

[11]Kopani M，Celec P，Danisovic L，et al.Oxidative stress and electron spin resonance[J].Clinica Chimica Acta，2006，364（1-2）：61-66.

[12]Mokbel M S，Hashinaga F.Evaluation of the antioxidant activity of extracts from buntan（Citrus grandis Osbeck） fruit tissues[J].Food Chemistry，2006，94（4）：529-534.

[13]馮翠萍，鄔瑕.果汁對DPPH自由基清除作用的研究[J].食品科技，2009，34（12）：144-146.

[14]王彤.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)與SPSS軟件應(yīng)用[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2008：102-110.

[15]國家標(biāo)準(zhǔn)局.GB/T 4086.4-1983統(tǒng)計分布數(shù)值表F分布[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1983.

[16]Gattuso G，Barreca D，Gargiulli C，et al.Flavonoid composition of citrus juices[J].Molecules，2007，12（8）：1641-1673.

[17]Pannala A S， Chan T S， O’Brien P J， et al.Flavonoid B-ring chemistry and antioxidant activity：Fast reaction kinetics[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，282（5）：1161-1168.

[18]Kesinger N G，Stevens J F.Covalent interaction of ascorbic acid with natural products[J].Phytochemistry，2009，70（17-18）：1930-1939.

Comparative study on DPPH radical scavenging capacities of lemon juice based on two methods

ZHOU Yue，ZHANG Na*，LIN Tai-feng，ZHONG Ru-gang
（College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China）

TS255.44

A

1002-0306（2012）16-0176-04

2012-01-13 *通訊聯(lián)系人

周玥（1985-），男，碩士，研究方向：食品安全與分子毒理學(xué)。