玉米淀粉酶脫支處理過程的優化研究

高惠梅，趙 凱，劉麗艷，劉婧婷

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076；2.天津實發中科百奧工業生物技術有限公司，天津300462）

玉米淀粉酶脫支處理過程的優化研究

高惠梅1，2，趙 凱1，*，劉麗艷1，劉婧婷1

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076；2.天津實發中科百奧工業生物技術有限公司，天津300462）

為優化酶脫支水解過程，在單因素實驗的基礎上，采用響應曲面法對酶脫支水解的3個主要影響因素即：pH、溫度、和酶添加量進行優化。建立了各因素與酶脫支水解產生還原力之間的數學模型。得出的最佳處理條件為：溫度56℃、pH5.1、酶添加量28.92U/g。模型R2=0.9438，說明其擬合程度良好，可以用該模型優化酶脫支處理玉米淀粉的過程。

酶脫支，普魯蘭酶，響應曲面，玉米淀粉，優化

Abstract：The process of enzyme debranching corn starch was investigated.Based on the single factor experiment，the effect of pH，temperature and enzyme concentration on the yield of reducing value were optimized with Response Surface Methodology（RSM）.A mathematical model was established between the studied factors and the responses.The optimal conditions were as follows：temperature 56℃，pH5.1，and enzyme concentration 28.92U/g.The R2of 0.9438 means that the results were in good agreement with predicted values and the model was useful for optimizing the enzyme debranching process.

Key words：enzyme debranching；pullulanase；response surface methodology；corn starch；optimization

淀粉脫支酶能夠專一性切開支鏈淀粉分支點的α-1，6糖苷鍵。根據脫支酶的作用方式，可將其分為直接脫支酶和間接脫支酶。前者可水解未經改性的支鏈淀粉或糖原中α-1，6糖苷鍵，而后者只能作用于已由其他酶改性的支鏈淀粉或糖原[1]。普魯蘭酶屬于直接脫支酶，它在以淀粉為原料的食品加工中有著重要的作用。普魯蘭酶和葡萄糖淀粉酶協同作用可提高淀粉水解速率，減少葡萄糖淀粉酶的用量[2]。Slominska L等研究表明，降低底物濃度，提高酶添加量和反應時間，可以增加環狀糊精的產量[3]。淀粉經過普魯蘭酶脫支處理后產生很多短直鏈淀粉，導致淀粉凝沉形成新晶體。新形成的晶體結構能延緩淀粉消化，從而形成緩慢消化淀粉。Soto R A G等研究表明每100g蠟質淀粉用10g普魯蘭酶水解4h后在1℃儲藏，可獲得較高得率的緩慢消化淀粉[4]。影響普魯蘭酶活力的因素有：溫度、pH、離子強度、底物濃度、酶濃度、脫支時間等[5]。這些因素對普魯蘭酶脫支過程有重要影響。因此建立一個模型，把酶脫支程度和脫支過程的影響因素聯系起來，對普魯蘭酶進一步開發應用有重要意義。響應曲面法是數學與統計學相結合的產物，它能以最經濟的方式，以最少的實驗數量和時間對實驗進行全面研究。以回歸方法作為函數估算的工具，將多因子實驗中，因子與實驗結果的相互關系，用多項式近似，把二者的關系函數化，依此可對函數進行分析，研究因子與響應值之間、因子與因子之間的相互關系，并進行優化[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉 黑龍江龍鳳玉米開發有限公司；普魯蘭酶（酶活力400U/g）直鏈淀粉 Sigma-Aldrich Chemical Co.，Ltd.；冰醋酸、無水醋酸鈉、3，5-二硝基水楊酸 均為國產分析純。

BS224S電子分析天平 賽多利斯科學儀器北京有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；THZ-82A水浴恒溫振蕩器 江蘇榮華儀器制造有限公司；80-2離心分離機 上海浦東物理光學儀器廠；SP-721E可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；DHG-9203A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 還原力的測定 將玉米淀粉配成一定濃度的淀粉乳，在95℃水浴中糊化20min，調節淀粉糊的pH、溫度、酶添加量，進行酶解實驗。酶水解1h后，將酶解液在100℃水浴中滅酶20min，冷卻離心，用3，5-二硝基水楊酸（DNS）測定上清液中還原糖的量。用上清液的還原力表示酶脫支水解程度[7]。

1.2.2 直鏈淀粉含量的測定 GB/T 15683-2008[8]。

1.2.3 pH對淀粉酶脫支程度的影響 根據預實驗的結果，設定酶脫支反應的溫度57.5℃，酶添加量20U/g，底物濃度2%，研究pH分別為3.5、4.0、4.9、5.5、6.5時，對酶脫支程度的影響。

1.2.4 溫度對淀粉酶脫支程度的影響 根據預實驗的結果，設定酶脫支反應的pH4.9，酶添加量20U/g，底物濃度2%，研究溫度分別為40、45、50、57.5、65℃時，對酶脫支程度的影響。

1.2.5 酶添加量對淀粉酶脫支程度的影響 根據預實驗的結果，設定酶脫支反應的pH4.9，溫度為57.5℃，底物濃度2%，研究酶添加量分別為5、10、20、30、40、50、70U/g時，對酶脫支程度的影響。

1.2.6 底物濃度對淀粉酶脫支程度的影響 根據預實驗的結果，設定酶脫支反應的pH4.9，溫度為57.5℃，酶添加量為20U/g，研究底物濃度分別為1%、1.5%、2%、3%、4%時，對酶脫支程度的影響。

1.2.7 響應曲面的實驗設計 通過前面研究表明溫度、pH、酶添加量這三個因素對酶脫支過程有顯著影響。采用中心組合實驗設計對這三個因素進行優化，以脫支水解后上清液中還原力的變化為響應值，優化實驗的水平及因素見表1。

表1 實驗因素水平編碼表Table 1 Coded values of the variables for the Box-Behnken design

1.2.8 數據處理 采用SPSS18.0軟件進行數據處理、統計分析，采用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 酶脫支處理對還原力和直鏈淀粉含量的影響

圖1 酶脫支處理對還原力和直鏈淀粉含量的影響Fig.1 The effect of enzyme debranching on the reducing value（RV）and amylose content

下圖為淀粉乳濃度為2%，酶濃度為20U/g的條件下，脫支處理過程中還原力和直鏈淀粉含量的變化情況。從圖1中可以看出，隨著脫支時間的延長，酶濃度的增加，還原力、直鏈淀粉含量都呈上升趨勢，而且二者趨勢一致，所以在后續實驗中，我們可以用還原力作為脫支程度的檢測指標，考察不同酶脫支處理條件對脫支程度的影響。

2.2 pH對淀粉脫支程度的影響

pH改變普魯蘭酶活力中心上有關基團的電離狀態，從而影響淀粉與酶的結合。酶的活力受環境pH的影響極為顯著，通常在一定pH范圍內才表現它的活性。由圖2可見，pH在4～5.5區間，還原力較高；當pH＜3.5及pH＞6時，酶的空間結構破壞，引起酶構象的改變，使普魯蘭酶活性降低，從而還原力降低?？梢?～5.5為酶脫支處理的最適pH范圍。

圖2 pH對還原力影響Fig.2 The effect of pH on the RV

2.3 溫度對淀粉酶脫支程度的影響

圖3可見，在40～50℃區間隨著溫度升高，還原力逐漸增加。反應速度隨著溫度升高而增加。但隨著溫度繼續升高，尤其在超過57.5℃后，反應速度下降，還原力降低。溫度升高，酶分子吸收過多能量，易引起其維持構象的次級鍵斷裂，導致酶蛋白變性，反應速度隨溫度升高的效應將逐漸為酶蛋白變性效應抵消，反應速度迅速下降。所以酶脫支處理的適宜溫度范圍應為50～60℃。

圖3 溫度對還原力影響Fig.3 The effect of temperature on the RV

2.4 酶添加量對淀粉酶脫支程度的影響

由圖4可見，隨著酶添加量增加，還原力逐漸上升，酶添加量和還原力成線性關系，說明底物沒有被酶飽和，此時的反應速度取決于酶添加量。隨著酶添加量的增加，酶底復合物生成也增多，此時反應速度取決于酶底復合物的濃度，故反應速度隨著酶添加量的增加而增高。但當酶添加量大于50U/g后，還原力增加緩慢，從經濟角度考慮，選擇低酶添加量（40U/g以下）。

2.5 底物濃度對淀粉酶脫支程度的影響

圖4 酶添加量對還原力影響Fig.4 The effect of enzyme concentration on the RV

圖5 底物濃度對還原力影響Fig.5 The effect of substrate concentration on the RV

由圖5可見，隨著底物濃度增加，還原力逐漸上升，底物濃度和還原力成線性關系。這主要是因為酶添加量較低，酶脫支時間較短，酶脫支水解的產物較少，產物競爭性抑制作用不明顯，同時由于酶脫支水解產生的直鏈淀粉含量較少，直鏈淀粉之間沒有產生凝沉現象。故還原力隨著底物濃度的增加而增高。考慮到淀粉糊粘度隨著底物濃度增加而增大，底物濃度高于4%會導致操作困難，故底物濃度應低于4%。

2.6 響應曲面的實驗設計及結果分析

通過前面研究表明，溫度、pH和酶添加量這三個因素對酶脫支過程有顯著影響。采用響應曲面分析對這三個因素進行優化，以脫支水解后上清液中還原力的變化為響應值，用中心組合實驗設計三因素五水平實驗。優化實驗的水平及因素見表1。設該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程可表達為：

表2 實驗安排及實驗結果表Table 2 Box-Behnken Design matrix and experimental results

式中，Y為預測響應值，C0為常數項，C1、C2、C3分別為線性系數，C12、C13、C23為交互項系數，C4、C5、C6為二次項系數。為了確立二次多項方程式（1），利用Design Expert軟件來進行實驗設計和數據分析。實驗設計方案和結果見表2。

利用Design Expert軟件，通過表2中實驗數據對方程式（1）進行多元回歸擬合，獲得上清液中的還原力對自變量pH、溫度、酶添加量的二次多項回歸方程式（2）：

對回歸模型作顯著檢驗和方差分析（見表3、表4）：p值越小，說明影響越顯著[9]。模型F=18.65，p＜0.0001，說明模型回歸效果是顯著的，模型的校正系數Radj2=0.8932，說明有89.32%的變量可以用回歸模型解釋[10]。通過對回歸方程各項方差分析得到一次項X1（溫度）、X2（pH）、X3（酶添加量），二次項中的X1、X2對響應值影響顯著，X2和X3交互作用對響應值影響顯著。通過對預測值和真實值作圖得到的各個點基本在一條直線上，說明模型擬合很好。失擬項p=0.2651＞0.05，失擬項不顯著，說明真實值和預測值擬合結果較好。

利用軟件對回歸方程求解得到最佳脫支條件為：溫度56.05℃、pH5.09、酶添加量28.92U/g，此條件下預測值為1.4128mg/mL?？紤]到實際操作的方便，將最佳脫支條件改為：溫度56℃、pH5.1、酶添加量28.92U/g。在此條件下的實際值為1.4146mg/mL，與預測值基本相符。

表3 二次多項模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for the quadratic mode

表4 回歸方程各項方差分析Table 4 Significance of the coefficients of regression

通過前面分析，實驗得到的二次方程能很好地預測在實驗范圍內不同單因素條件下的響應值。為了進一步確定方程的可靠性，在實驗范圍內，隨機做三個驗證實驗來驗證方程的可靠程度。實驗安排見表5。

表5 驗證實驗Table 5 Confirmation experiment

驗證實驗的實際值和預測值的誤差在0.2%～5%之間，殘差的正態分布圖在一條直線上，通過殘差對預測值作圖，殘差分布無規律。通過以上的分析得出通過實驗得到的回歸方程的精確度很高[11-12]。

3 結論

將單因素實驗和響應曲面結合對酶脫支水解玉米淀粉進行優化，獲得的最佳工藝條件為：溫度56℃、pH5.1、酶添加量28.92U/g。通過響應曲面的分析及驗證實驗表明，可以用響應曲面法優化酶脫支處理玉米淀粉的過程，同時可以通過響應曲面分析得出酶脫支水解的重要影響因素及預測酶脫支水解過程。

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Optimization of enzyme debranching process of corn starch

GAO Hui-mei1，2，ZHAO Kai1，*，LIU Li-yan1，LIU Jing-ting1
（1.Key Laboratory for Food Science and Engineering，College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.Tianjin SF-Bio Industrial Bio-tee Co.，Ltd.，Tianjin 300462，China）

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）16-0191-04

2011-12-06 *通訊聯系人

高惠梅（1985-），女，碩士，研究方向：淀粉化學與工藝學。

黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃（1251G025）；黑龍江省高?？萍紕撔聢F隊建設計劃（2010td04）。