響應(yīng)面法優(yōu)化蜂膠黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

李富華，夏春燕，劉燕妮，明 建，2，3，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

響應(yīng)面法優(yōu)化蜂膠黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

李富華1，夏春燕1，劉燕妮1，明 建1，2，3，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

采用響應(yīng)面法對(duì)蜂膠黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以蜂膠為原料，基于單因素實(shí)驗(yàn)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度為相應(yīng)因素、蜂膠黃酮提取率為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，確定最佳提取工藝條件為：液料比14∶1（mL·g-1）、提取溫度72.6℃、提取時(shí)間2.5h、乙醇濃度80%（v/v），在此條件下理論提取率為33.9324%，與實(shí)測值基本相符，說明優(yōu)化工藝可行。以VC為對(duì)照物，經(jīng)DPPH法和鐵氰化鉀法驗(yàn)證蜂膠黃酮的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)蜂膠黃酮具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力和還原能力，可作為優(yōu)良的天然抗氧化劑資源。

蜂膠，黃酮，響應(yīng)面法，抗氧化活性

Abstract：Propolis flavonoids were extracted by ethanol，and the extraction process was optimized by response surface analysis.On the basis of one-factor-at-a-time experiment，optimal extraction conditions for maximizing popolis flavonoids were determined by using a 4-variable，3-level Box-Behnken experimental design combined with response surface analysis as follows：the liquid-material ratio was 14∶1（mL·g-1），the extraction temperature was 72.6℃ ，the extraction time was 2.5h，the ethanol concentration was 80% （v/v），resulting in an propolis flavonoids yield of 33.82%，which was basic agreement with the predicted value of 33.9324%.Thus，the optimal process was reliable.The antioxidant activity in vitro condition of propolis flavonoids were evaluated by DPPH free radical scavenging assay and potassium ferricyanide reduction assay using VCas the control.Propolis flavones were found to have powerful DPPH free radical scavenging capacity and reducing power.Thus，propolis flavonoids could be developed as excellent natural antioxidant resources.

Key words：propolis；flavone；response surface methodology（RSM）；antioxidant activity

蜂膠是蜜蜂從膠源植物的樹芽、樹皮等部位采集的樹脂，再混合蜜蜂舌腺和蠟腺等腺體分泌物及少量花粉，經(jīng)蜜蜂反復(fù)代謝合成的一種具芳香氣味的粘性膠狀固體，具有抵御病蟲害和病原微生物入侵蜂巢的作用，也被用于修補(bǔ)巢房和內(nèi)環(huán)境消毒殺菌。蜂膠常由55%的樹脂，30%蜂蠟，10%芳香揮發(fā)油，5%花粉及雜質(zhì)組成，其中的天然活性成分達(dá)20余類，300多種，主要有黃酮類、萜烯類、酚類、醛類、酸類、芳香類、酶類、氨基酸、脂肪酸、維生素和多糖類等，有“黃酮類化合物的寶庫”和“紫色黃金”的美譽(yù)[1-3]。黃酮類物質(zhì)的生理活性主要體現(xiàn)在其抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等方面，以功能性添加劑的形式被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品領(lǐng)域[4-9]。鑒于此，蜂膠已成為保健食品研究領(lǐng)域的開發(fā)熱點(diǎn)，故對(duì)蜂膠活性成分——蜂膠黃酮提取的研究具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究采用響應(yīng)面（response surface methodology，RSM）分析法對(duì)蜂膠黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最優(yōu)工藝參數(shù)，并對(duì)蜂膠黃酮提取液的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，旨為蜂膠的綜合開發(fā)利用提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂膠 奉節(jié)縣百香蜂業(yè)有限公司提供；蘆?。ㄉ噭俊?5%） 上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl） 美國Sigma公司；無水乙醇、三氯化鐵、鐵氰化鉀、氫氧化鈉、硝酸鋁、抗壞血酸等 均為分析純?cè)噭?/p>

FA2004型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；DFT-100型手提式高速中藥粉碎機(jī) 溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；SHB-（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；722型分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂膠預(yù)處理 蜂膠經(jīng)水洗除雜后于0℃下冷凍12h，在低溫干燥狀態(tài)時(shí)取樣，快速短時(shí)粉碎（10s，以防發(fā)粘），收集粉末，密封，置于-18℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蜂膠總黃酮提取 精確稱取2.50g蜂膠粉末，按1.2.4及1.2.5設(shè)置的工藝參數(shù)及條件進(jìn)行提取，提取液經(jīng)抽濾后，濾液用乙醇定容至100mL棕色容量瓶中，置于-80℃避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總黃酮含量測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：采用硝酸鋁比色法測定[10]，準(zhǔn)確稱取11.2mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，60%乙醇溶解并定容至50mL，得濃度為0.224mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5mL置于25mL棕色容量瓶中，加1mL 5%NaNO2，混勻靜置6min，加1mL 10%Al（NO3）3溶液，混勻靜置6min，加10%NaOH 10mL，60%乙醇定容，靜置15min，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，于510nm處測定吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=12.985X-0.0019，R2=0.9995。

檢測蜂膠總黃酮含量：準(zhǔn)確吸取蜂膠提取液1mL，以60%乙醇為稀釋液，依次稀釋100、50、12.5倍，最終釋至0.000016mg/mL，按上述方法測定樣品中黃酮含量。

1.2.4 蜂膠總黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和液料比4個(gè)因素對(duì)蜂膠總黃酮提取率的影響，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。按以下公式計(jì)算提取率：

式中：X—由回歸方程計(jì)算出蜂膠黃酮的濃度（mg/L）；25—吸取不同體積的蜂膠黃酮提取液，最終定容至25mL；2.5—稱取的蜂膠質(zhì)量（g）。

除了考察提取時(shí)間對(duì)蜂膠黃酮提取率的影響時(shí)樣品稀釋倍數(shù)為2000，其余的樣品稀釋倍數(shù)均為2500。

1.2.4.1 乙醇濃度 在提取溫度35℃、時(shí)間2h、液料比10∶1（mL/g）的條件下，考察50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液對(duì)蜂膠黃酮提取率的影響。

1.2.4.2 提取時(shí)間 在提取溫度35℃、乙醇濃度80%、液料比10∶1的條件下，考察浸提時(shí)間0.5、1.0、2.0、3.0、4.0h對(duì)蜂膠黃酮提取率的影響。

1.2.4.3 提取溫度 在乙醇濃度80%、提取時(shí)間2.0h、液料比10∶1的條件下，考察浸提溫度35、45、55、65、75℃對(duì)蜂膠黃酮提取率的影響。

1.2.4.4 液料比 在乙醇濃度80%、提取時(shí)間2.0h、溫度65℃的條件下，考察液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）對(duì)蜂膠黃酮提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件 根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）為相應(yīng)因素，蜂膠黃酮提取量（Y）為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 蜂膠黃酮提取響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 Variables and levels in response surface design

1.2.6 抗氧化性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測定[11]分別檢測20、40、60、80、100μg/mL的VC對(duì)0.1mmol·L-1的DPPH溶液的自由基清除率并繪制曲線，以此作為對(duì)照；分別檢測17、34、51、68、85μg/mL的黃酮提取液對(duì)0.1mmol·L-1的DPPH溶液的自由基清除率并繪制曲線，確定達(dá)到同一DPPH·自由基清除率時(shí)所對(duì)應(yīng)的VC與黃酮的濃度值，濃度值越小其清除DPPH·自由基的能力越強(qiáng)，對(duì)應(yīng)的抗氧化性也就越強(qiáng)；反之，清除DPPH·自由基的能力弱，對(duì)應(yīng)的抗氧化性也弱。

準(zhǔn)確吸取1mL蜂膠提取液，加入5mL 0.1mmol·L-1的DPPH溶液，室溫下避光靜置50min，以甲醇作空白，于517nm處測吸光值A(chǔ)，按下列公式計(jì)算清除率，以清除率為縱坐標(biāo)，樣品液濃度為橫坐標(biāo)作圖，以VC作陽性對(duì)照。

式中：A樣品為樣液吸光值；A空白為空白液吸光值。1.2.6.2 還原力測定（鐵氰化鉀法）[4]分別檢測10、20、30、40、50μg/mL的VC以及17、34、51、68、85μg/mL的黃酮提取液在700nm波長處的吸光值，并繪制對(duì)照品VC與蜂膠黃酮的還原力曲線，當(dāng)達(dá)到同一吸光值時(shí)，所需的樣品濃度值越小，證明其還原力越強(qiáng)，即其抗氧化性強(qiáng)。

1mL蜂膠提取液，加入1mL 0.2mol·L-1的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS），1mL 1%K3[Fe（CN）6]溶液，于50℃條件下水浴20min，加入1mL 10%三氯乙酸、5mL去離子水和2.5mL 0.1%FeCl3，混勻靜置10min，于700nm處測吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，樣液濃度為橫坐標(biāo)作圖，以VC作陽性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，運(yùn)用Excel數(shù)據(jù)處理軟件和Design expert V 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度 由圖1可見，隨乙醇濃度的升高，蜂膠黃酮提取率呈先上升后略微下降趨勢(shì)，80%時(shí)達(dá)峰值。這是由于適當(dāng)濃度的乙醇溶液有利于黃酮類物質(zhì)的溶出，而當(dāng)乙醇濃度過高時(shí)，提取液揮發(fā)性增強(qiáng)，同時(shí)醇溶性雜質(zhì)、色素及親脂性成分溶出量增加而與乙醇競爭結(jié)合黃酮類物質(zhì)，從而導(dǎo)致乙醇提取率降低[12]。本實(shí)驗(yàn)將乙醇濃度的考察范圍定為70%～90%。

圖1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on flavones extraction rate

2.1.2 提取時(shí)間 由圖2可見，隨提取時(shí)間延長，黃酮提取率呈先升后降趨勢(shì)，2h時(shí)達(dá)峰值。這是由于黃酮本身具有還原性，長時(shí)間加熱將使黃酮發(fā)生變性[13]。本實(shí)驗(yàn)將提取時(shí)間的考察范圍定為1～3h。

圖2 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on flavones extraction rate

圖3 提取溫度對(duì)蜂膠黃酮的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on flavones extraction rate

2.1.3 提取溫度 由圖3可見，隨溫度升高，黃酮提取率呈先升后降趨勢(shì)，65℃時(shí)達(dá)峰值。這是由于溫度升高，雜質(zhì)溶出量增大且黃酮類遭到破壞，此外，高溫下乙醇揮發(fā)，液料比改變而導(dǎo)致提取率下降。本實(shí)驗(yàn)將提取溫度的考察范圍定為55～75℃。

2.1.4 液料比 由圖4可見，隨液料比增加，黃酮提取率呈先升后降趨勢(shì)，15∶1時(shí)達(dá)峰值。溶劑量增加使物料與溶劑接觸面積、溶液傳質(zhì)推動(dòng)力均增大[14]，將使黃酮提取率升高，但液料比過大使雜質(zhì)溶出多，且濃縮成本高。本實(shí)驗(yàn)將液料比考察范圍定為10∶1～20∶1。

圖4 液料比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of liquid/material ratio on flavones extraction rate

2.2 蜂膠總黃酮提取工藝優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn) 基于單因素實(shí)驗(yàn)，采用響應(yīng)面法對(duì)蜂膠總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）為響應(yīng)因素，蜂膠總黃酮提取量（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，得出蜂膠總黃酮得率的四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（見表2）。

采用國際通用的Design expert V 7.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以蜂膠總黃酮提取率為目標(biāo)函數(shù)，關(guān)于各條件編碼值的二次回歸方程為：

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，得方差分析表（表3）。

由表3可知，模型極顯著（p=0.0001＜0.01），實(shí)驗(yàn)所選取的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性，失擬項(xiàng)在a=0.05的水平上不顯著（p=0.1378＞0.05），其校正系數(shù)R2=89.57%，因此該模型擬合度較好。模型信噪比RSN=9.823遠(yuǎn)大于4，即該模型可用于預(yù)測。綜合以上各參數(shù)表明該實(shí)驗(yàn)方法可靠，各因素水平間設(shè)計(jì)合理，因此可用該回歸方程模擬實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

該二次回歸模型的一次項(xiàng)：B極顯著（p=0.0086＜0.01），A顯著（p=0.0166＜0.05）；交互項(xiàng)：BC極顯著（p=0.0063＜0.01）、CD顯著（p=0.0380＜0.05）；二次項(xiàng)：A2、B2、C2、D2均極顯著（p＜0.01）。各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)蜂膠總黃酮提取率的影響排序?yàn)椋禾崛囟龋疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞液料比。

2.2.2 蜂膠總黃酮提取率的響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對(duì)各實(shí)驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，可直觀的反映各實(shí)驗(yàn)因素的交互作用[4，9，15]。對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中顯著交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖見圖5～圖7。

表2 蜂膠總黃酮提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Process variables and levels in response surface designarrangement and experimental response values

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

圖5 乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of ethanol concentration and extraction time on flavones extraction rate

圖6 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.6 Effects of extraction temperature and extraction time on flavones extraction rate

圖7 液料比與提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of liquid/material ratio and extraction time on flavones extraction rate

圖5～圖7直觀地展現(xiàn)出各因子交互作用的響應(yīng)曲面3D分析圖，等高線的形狀可反映出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反，同時(shí)有閉合的橢圓或圓表示有最大值[14-15]。

2.2.3 蜂膠總黃酮提取工藝條件的優(yōu)化 經(jīng)Design expert V 7.0統(tǒng)計(jì)軟件優(yōu)化，蜂膠總黃酮最佳提取工藝條件為：液料比13.91∶1（mL·g-1），提取溫度72.58℃，提取時(shí)間2.55h和乙醇濃度80.64%，此時(shí)蜂膠總黃酮的最大提取率33.9324%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將提取工藝條件修正為液料比14∶1（mL·g-1）、提取溫度72.6℃、提取時(shí)間2.5h、乙醇濃度80%。為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到黃酮的實(shí)際平均提取率為33.82%，與理論預(yù)測值接近，表明建立的數(shù)學(xué)模型對(duì)蜂膠總黃酮提取工藝具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 蜂膠黃酮抗氧化活性測定

2.3.1 DPPH·清除能力實(shí)驗(yàn) 從圖8可見，一定濃度范圍內(nèi)，DPPH·清除率隨濃度增加而增大。當(dāng)清除率均達(dá)90%時(shí)，所需的VC和蜂膠黃酮提取液的濃度分別為40、80μg/mL左右，可見蜂膠黃酮具有一定的自由基清除力，但弱于VC。

圖8 VC與蜂膠黃酮對(duì)多DPPH·自由基的清除能力Fig.8 DPPH·radical scavenging activities of VCand propolis flavone

2.3.2 還原能力實(shí)驗(yàn) 從圖9可見，一定濃度范圍內(nèi)，VC和蜂膠黃酮的還原力隨其濃度增加而增大。當(dāng)吸光度均達(dá)0.3時(shí)，所需的VC和蜂膠黃酮提取液濃度分別為在30、50μg/mL，說明蜂膠黃酮具有較強(qiáng)的還原能力，但弱于VC。

圖9 VC與蜂膠黃酮還原能力測定Fig.9 Reduceing power of VCand propolis flavone

3 結(jié)論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蜂膠黃酮的含量隨著提取時(shí)間、提取溫度、液料比的增加呈明顯地先升高后下降趨勢(shì)，而隨著乙醇濃度的升高黃酮含量略顯下降。

3.2 響應(yīng)面分析法得到四因素對(duì)蜂膠黃酮提取率影響的大小關(guān)系是：提取溫度＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞液料比。優(yōu)化出的蜂膠黃酮最優(yōu)提取工藝為：液料比14∶1（mL·g-1）、提取溫度72.6℃、提取時(shí)間2.5h、乙醇濃度80%。

3.3 蜂膠黃酮具有一定的抗氧化能力，可作為天然抗氧化劑的開發(fā)資源。

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Optimization of extraction process of propolis flavonoids by response surface methodology and its antioxidant activity research

LI Fu-hua1，XIA Chun-yan1，LIU Yan-ni1，MING Jian1，2，3，*
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center，Chongqing 400715，China；3.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation（Chongqing），Ministry of Agriculture，Chongqing 400715，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）20-0226-05

2012-06-25 *通訊聯(lián)系人

李富華（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。

國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2010GA811001）。