響應面分析法優化臍橙皮中多酚類物質提取工藝

秦 艷，馮衛華，*，白衛東，2，譚杏婷，沈 棚

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；2.華南農業大學食品學院，廣東廣州510642）

響應面分析法優化臍橙皮中多酚類物質提取工藝

秦 艷1，馮衛華1，*，白衛東1，2，譚杏婷1，沈 棚1

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；2.華南農業大學食品學院，廣東廣州510642）

目的：利用響應面優化法對臍橙皮粗多酚的提取條件進行優化。方法：在單因素實驗基礎上選取實驗因素與水平，根據Box-Behnken Design（BBD）實驗設計原理采用三因素三水平的響應面分析法，依據回歸分析確定各工藝條件的影響因素，以臍橙皮多酚物質含量為響應值作響應面分析實驗。結果：分析各個因素的顯著性和交互作用后，得出臍橙皮多酚物質浸提的最佳工藝條件為乙醇體積分數51%、浸提溫度62℃、浸提時間2h、料液比1∶20（w/v）、浸提2次，臍橙皮多酚物質一次提取含量可達20.2mg/g。結論：曲面回歸方程與實驗結果擬合性好，此模型合理可靠，可用于實際預測。

臍橙皮，多酚物質，響應面分析

Abstract：Objective：The main research object was navel orange peel.Besides，an optimization of extraction process for from navel orange peel was established.Methods：Based on the single factor analysis，a 3-factor，3-level Box-Behnken experimental design was applied to evaluate the effect of the three factors，including extraction temperature，ethanol concentration and ratio of material to liquid.Results：The optimal extraction conditions were ethanol concentration of 51%（v/v），extraction temperature 62℃，extraction time 2h，solid-toliquid ratio 1∶20（w/v） and 2 times for extraction.Temperature was the most important affecting factor of polysaccharide extraction，followed by ethanolconcentration.Under such extraction conditions，the experimental yield of polyphenols obtained after the first extraction was up to 20.2mg/g.Condusion：It was close to predicted value.

Key words：navel orange peel；polyphenols；response surface methodology

臍橙人稱“柑橘之王”[1]，是蕓香科植物甜橙Citrus sinensis（L.）Os-beck栽培品種的成熟果實，是柑橘品種最優良的一個甜橙種類，其營養豐富，含有人體所必需的各種營養成分。柑橘加工過程中，皮渣是主要副產品，占總量的20%～40%[2]。臍橙皮渣中含有大量的植物活性成分——多酚，植物多酚為植物體內的復雜酚類次生代謝物，主要存在于植物的皮、根、葉、果中，在植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素[3]。許多實驗研究資料均顯示，植物多酚具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等方面的生理活性。多酚的這些生理活性與其具有的清除自由基和抗氧化性能密切相關[4]。研究表明，多酚的抗氧化能力很強，它在阻止血脂升高的同時，還可以增加高密度脂蛋白的含量[5]。因此，植物多酚已被稱作人類健康的“第7營養素”。多酚可用在保健食品中，起到強身健體的功效，也可用于食品中，以延長食品的貨架期[6]。多酚類物質能夠明顯抑制多種細菌、真菌、病毒和潰瘍，控制感染性疾病的發生[7-9]。同時，植物多酚在抗誘變、抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等方面具有良好的作用，對一些嚴重危害人體健康的疾病如高血壓、心臟病、癌癥等具有一定的治療或預防作用[10-13]。本文在單因素實驗的基礎上，選用響應面優化法對臍橙皮渣中多酚的提取進行了優化，期望為臍橙皮多酚方面的研究工作者們提供一定的參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙皮粉 臍橙，購于廣州好有多超市，臍橙手工去皮，除去臍橙皮內部纓絡，將臍橙皮在50℃下恒溫干燥，而后粉碎，過40目篩，橙皮粉密封后于常溫下保存備用；沒食子酸、福林酚試劑 Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO；Na2CO3，無水乙醇。

DU730型紫外可見分光光度計 美國BECKMAN COUCTER；HY-2型調速多用振蕩器 國華電器有限公司；FA1004型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；RE52-C型旋轉蒸發儀 鞏義市予華儀器設備有限公司；800型電動離心機 江蘇金城國盛實驗儀器廠。

1.2 多酚（TPC）的測定

1.2.1 沒食子酸標準曲線的建立 精確稱取沒食子酸0.50g，定容至100mL容量瓶中，再取此液1mL稀釋至100mL，得濃度為0.05mg/mL的標準溶液。精確量取0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mL置于10mL的離心管中，對應的沒食子酸含量分別為5、15、25、35、45μg，分別加入3mL蒸餾水，0.25mL的福林酚，1min后加入20%（w/v）Na2CO3溶液0.75mL混勻，用蒸餾水定容至5mL，混合液于75℃恒溫下水浴10min后，立即冰浴，離心（4500r/min，15min），于760nm波長測定吸光度值，以蒸餾水為對照。用Excel軟件對數據進行分析，以沒食子酸的含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得一元線性回歸方程。

1.2.2 多酚含量的測定 采用福林-肖卡法[14]。精確移取0.5mL多酚粗提液，按照繪制標準曲線方法顯色，于最大吸收波長760nm處測吸光度并計算含量。臍橙皮多酚的含量表示為每克干重樣品中含有的多酚量（以沒食子酸計，mg/g）。

1.3 單因素實驗

選用乙醇溶劑浸提法作為提取方法。對可能影響臍橙皮多酚得率的幾個因素（乙醇體積分數、料液比、提取時間和提取溫度）分別做單因素實驗，按照多酚的測定方法（福林-肖卡法），計算多酚含量。

1.3.1 乙醇體積分數的確定 稱取2g左右的臍橙皮粉，分別選用體積分數為30%、40%、50%、60%與70%的乙醇溶液作為提取液，料液比（w/v）：1∶20，在室溫下避光提取3h，過濾得到濾液，立即測定其多酚含量。

1.3.2 料液比的確定 稱取2g左右的臍橙皮粉末，選用體積分數為60%的乙醇溶液作為提取液，料液比（w/v）：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，在室溫下避光提取3h，過濾得到濾液，以1∶25所得濾液體積為標準，用60%的乙醇定容至該體積，立即測定其多酚含量。

1.3.3 提取溫度的確定 稱取2g左右的臍橙皮粉末，選用體積分數為60%的乙醇溶液作為提取液，料液比（w/v）為1∶20，分別在室溫（25℃）、40、50、60、70、80、90℃下避光提取3h，過濾得到濾液，立即測定其多酚含量。

4)實時交通路況和天氣預報技術。實時交通信息除包括城市道路擁堵情況外，還應該包括整個區域的交通狀況，路面的維修情況，路面情況等。實時天氣不僅指當年某個市或縣當天的天氣預報，還應包括即將發生或者已經發生的災害性氣象，出行目的地的天氣狀況等，具備動態的交通和天氣狀況，才能為客貨運輸、交通出行帶來很大方便。

1.3.4 提取時間的確定 稱取2g左右的臍橙皮粉末，選用體積分數為60%的乙醇溶液作為提取液，料液比（w/v）：1∶20，在室溫下避光分別提取1、2、3、4、5、6h，過濾得到濾液，立即測定其多酚含量。

1.4 提取條件的優化

根據單因素實驗對乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度進行綜合考慮，采用三因素三水平，根據Box-Behnken Design（BBD）設計法設計響應面實驗，分析臍橙皮多酚在不同提取條件下的含量，從而優化出最佳提取條件。實驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

1.5 驗證實驗

以臍橙皮為材料，采用優化的提取條件浸提，過濾得到濾液，立即測定提取液中的多酚含量。

1.6 浸提級數的確定

以臍橙皮為材料，采用優化的提取條件連續重復提取三次，立即測定每次提取液中的多酚含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

采用采用福林-肖卡法繪制沒食子酸標準曲線，得沒食子酸含量（X）與吸光值（Y）之回歸方程方程Y=0.0182X-0.0444，R2=0.9916。樣品中總酚含量以沒食子酸含量表示。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇體積分數對臍橙皮多酚含量的影響 由于乙醇浸提的選擇性好，對植物細胞的穿透能力強，浸出率高，提取時間短，溶解出的雜質少，提取物不易霉變，且乙醇毒性小，因此，參照有關文獻[15]，并在預備實驗的基礎上選用乙醇作為提取溶劑。又由于高溫、日照均不利于多酚的穩定[16]，因此本研究采用常溫避光提取。

圖1 乙醇體積分數對臍橙皮多酚含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from navel orange peel

圖1為在室溫（25℃）、料液比1∶20（w/v）、避光提取3h的條件下，乙醇體積分數對臍橙皮提取液中多酚含量的影響。當乙醇體積分數數達到50%時，提取液中多酚含量最大，之后隨著體積分數的增大，含量反而降低。主要是因為乙醇體積分數不同，極性也不同[17]，當乙醇體積分數為50%左右時，可能與臍橙皮多酚的極性相似，故臍橙皮多酚的溶解度最大；而乙醇體積分數偏離50%時，均不利于臍橙皮多酚的提取。因此，乙醇體積分數選定在50%左右為宜。

圖2 料液比對臍橙皮多酚含量的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of polyphenols from navel orange peel

2.2.3 提取溫度對臍橙皮多酚含量的影響 圖3為選用60%乙醇溶液為提取劑，在料液比為1∶20，避光提取3h的條件下，提取溫度對臍橙皮提取液多酚含量的影響。當溫度達到60℃時，提取液中多酚的含量達到最大，之后隨著溫度的升高含量反而降低。溫度是影響提取的重要因素之一。在一定的溫度范圍，提高溫度可能有利于多酚的提取；但是由于多酚中含有大量的酚羥基，其化學性質及其活潑，某些酚類物質在較高的溫度下不穩定[19]，故當提取溫度超過60℃時，臍橙皮多酚的含量隨著溫度的升高反而降低。Antolovich[19]的研究也發現，當溫度達到60℃后，多酚提取含量顯著下降。因此，臍橙皮多酚的提取溫度選為60℃左右。

圖3 溫度對臍橙皮多酚含量的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of polyphenols from navel orange peel

2.2.4 提取時間對臍橙皮多酚含量的影響 圖4為選用60%乙醇溶液作為提取劑、在室溫（25℃）、料液比1∶20的條件下，提取時間對臍橙皮提取液多酚含量的影響。臍橙皮提取液中多酚含量在2、3、4、5h時顯著高于1h（p＜0.05）；當提取時間超過2h后，延長提取時間，提取液中多酚含量無顯著差異（p＜0.05），但呈現下降趨勢，故延長提取時間有利于多酚的提取。但是由于多酚易氧化[20]，提取時間過長反而會破壞多酚類物質的酚羥基結構，導致其得率降低[21]。因此，提取時間選定為2h。

圖4 提取時間對臍橙皮多酚含量的影響Fig.4 Effect of time on extraction rate of polyphenols from navel orange peel

2.3 響應面法優化臍橙皮多酚提取工藝

2.3.1 響應面分析因素水平的選取 根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，結合上述單因素影響的實驗結果，選取乙醇體積分數（A）、料液比（B）和提取溫度（C）3個影響因素，在單因素實驗的基礎上采用三因素三水平的響應曲面分析方法，共15個實驗點。由Box-Behnken Design設計方案所得的實驗結果見表2。

表2 Box-Behnken設計方案及其響應值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

2.3.2 數學模型及其顯著性檢驗 按照Design Expert軟件中的Box-Behnken Design模型對表2的數據進行多元回歸擬合，得到多酚含量對乙醇體積分數（A）、液料比（B）、提取溫度（C）的二次多項回歸模型為：Y=20.14+0.32A+0.49B+0.64C-3.16A2-1.57B2-1.53C2-0.022AB+0.27AC-0.24BC，對該模型進行顯著性檢驗，結果見表3，回歸模型系數顯著性檢驗見表4。

表3 多酚提取回歸模型的方差分析結果Table 3 Analysis of variance for quadratic polynomial modeI of polyphonoI extraotion

表4 多酚提取回歸方程系數顯著性檢驗結果Table 4 Test result of significance for regression coefficient of polyphenol extraction

由表3可知，整體模型顯著性水平p＜0.01，表明二次方程模型達到極顯著水平；同時失擬項p=0.0681＞0.05，表明差異不顯著，說明殘差均由隨機誤差引起。由表4可知，調整系數R2=0.9967，說明響應值的變化有99.67%來源于所選變量，即提取溫度、乙醇體積分數和料液比；相關系數R為0.9983，表明實測值與預測值高度相關。綜合以上所述，說明模型擬合程度良好，實驗誤差小。因此，該模型可較好地描述各因數與相應值之間的真實關系，可利用模型來分析和預測臍橙皮多酚的提取工藝結果。

由表4回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，回歸方程的一次項A、B、C顯著，并且可看出影響順序為：C＞B＞A，即：提取溫度＞料液比＞乙醇體積分數；二次項A2、B2、C2極顯著；交互項除AC外，其他均不顯著（p＞0.05）。

2.3.3 響應面優化與分析 利用Design Expert 7.1.6軟件，繪制各影響因素對臍橙皮多酚含量的響應曲面圖，考察所擬合的響應面的形狀，分析乙醇體積分數（A）、料液比（B）和提取溫度（C）對臍橙皮多酚含量的影響。如果一個響應曲面坡度相對平緩，表明其可以忍受處理條件的變異，而不影響到響應值的大小，相反，如果一個響應曲面坡度異常陡峭，表明響應值對于處理條件的改變非常敏感[22]。

比較圖5～圖7可知，乙醇濃度、料液比和提取時間對臍橙皮多酚含量的影響極為顯著，表現為曲面較陡，其中提取溫度對臍橙皮多酚含量的影響最大。另外，結合等高線的疏密程度可看出，圖6響應面曲面較陡且等高線較緊密，故乙醇體積分數與提取溫度之間的交互作用比較強，而乙醇體積分數與料液比、料液比與提取溫度之間兩兩交互作用比較弱。

圖5 乙醇體積分數與料液比對多酚含量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration and material-to-liquid ratio on extraction rate of polyphenols

圖6 乙醇體積分數與提取溫度對多酚含量的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration and extracting temperature on extraction rate of polyphenols

圖7 提取溫度與料液比對多酚含量的影響Fig.7 Effect of extracting temperature and extracting time on extraction rate of polyphenols

2.3.4 優化與驗證 從上述回歸模型中求得最優工藝條件為體積分數50.58%，料液比1∶20.69，溫度62.01℃，臍橙皮提取液多酚含量的理論值為20.24mg/g。由于以上最佳條件未包括在響應面優化的15組實驗中，需進一步進行實驗驗證。為了操作方便，將以上條件修正為乙醇體積分數51%、提取溫度62℃、料液比1∶20。驗證實驗結果表明，在最佳提取條件下，臍橙皮提取液多酚含量為20.2mg/g（RSD=0.58%），與預測值相差不大，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應面法適用于臍橙皮多酚提取工藝進行回歸分析和參數優化。

2.4 浸提次數的確定

圖8 浸提次數對臍橙皮多酚含量的影響Fig.8 Effect of extraction number on extraction rate of polyphenols from navel orange peel

圖8為選用51%乙醇溶液為提取液，在溫度62℃、提取2h、料液比1∶20的條件下連續重復提取臍橙皮多酚3次，測定每次提取液的多酚含量。每次提取占總的多酚提取量的比例分別為72.10%、18.58%和9.33%。前兩次提取的多酚量占總提取量的90.67%。因此，本研究確定浸提次數為2次。

3 結論

在單因素的實驗基礎上，運用響應面實驗方法，結合回歸模型的數學分析，對臍橙皮多酚提取工藝進行了優化。通過實驗得到的最優工藝參數為乙醇體積分數51%、浸提溫度62℃、浸提時間2h、料液比1∶20（w/v）、浸提2次，在此條件下，臍橙皮多酚得率可達20.2mg/g。

[1]胡正月，朱清能，謝日星.國外臍橙育種與栽培概況綜述[J].江西園藝，2000（5）：29-30.

[2]劉曉軍.柑橘加工副產品加工利用[J].農產品加工·學刊，2007（11）：29-30.

[3]王旗，劉恩岐.植物多酚的研究現狀[J].山西農業科學，2009，37（1）：92-94.

[4]宋立江，狄瑩.植物多酚的研究與利用的意義及發展趨勢[J].化學進展，2004，5（2）：162.

[5]李雪瑩，王文杰.植物單寧的生理作用及經濟價值[J].內蒙古林業科技，2004，4（4）：22.

[6]Abram V，Donko M.Tentative Identification of polyphenols in sempervivum tectorum and assessment of the antimicrobial activity of sempervivum L[J].J Agric Food Chem，1999，47（2）：485-489.

[7]Chung KT， Wong TY， Wei CI， et al.Tannins and human health：A review[J].Crit Rev Food Sci，1998，38：421-464.

[8]Ikken Y，Morales P，Martinez A，et al.Antimutagenic effect of fruit and vegetable ethanolic extracts against N-nitrosamines evaluated by the Ames test[J].J Agric Food Chem，1999，47（8）：3257-3264.

[9]Vilevas W，Sanomimiya M，Rastrelli L，et al.Isolation and structure elucidation of two new flavonoid glycosides from the infusion of maytenus aquifolium leaves.Evaluation of the antiulcer activity of the infusion[J].J Agric Food Chem，1999，47（2）：403-406.

[10]Hertog MGL， Hollman PCH，van de Putte B.Content of potencially anticarcinogenic flavonoids of tea infusion，wines，and fruit juices[J].J Agric Food Chem，1993，41（8）：1242-1246.

[11]Dupont MS，Bennet RN，Mellon FA，et al.Polyphenols from alcoholic apple cider are absorded，metabolized，and excreted by humans[J].J Nutr，2002，132（2）：172-175.

[12]Leontowiez H，Gorinstein S，Loejej A，et al.Comparative content of some bioactive compounds in apples，peaches，and pears and their influence on lipids and antioxidant capacity in rats[J].J Nutr Biochem，2002，13（10）：603-610.

[13]Chinnici F，Bendini A，Gaiani A，et al.Radical scavenging activities of peels and pulps from cv.Golden Delicious apples as related to their phenolic composition[J].J Agric Food Chem，2004，52（15）：4684-4689.

[14]雷昌貴，陳錦屏，盧大新，等.食品中多酚類化合物的測定方法及其研究進展[J].食品發酵與工業，2007，33（1）：100-104.

[15]Hinneburg I，Neubert RHH.Influence of Extraction parameters on the phytochemical characteristics of extracts from buckwheat（Fagopyrum esculentum） Herb[J].J Agric Food Chem，2005，53（1）：3-7.

[16]彭長連，林植芳，林桂珠.光對大本植物葉片清除有機自由基能力的影響[J].植物學報，2000，42（4）：393-398.

[17]伍春，徐立，劉駿馳，等.響應曲面法優化新疆藥桑桑皮總多酚提取工藝[J].食品科學，2011（2）：104-107.

[18]Rubilar M，Pinelo M，Ihl M，et al.Murta leaves （Ugni molinae Turcz）as a source of antioxidant polyphenols[J].J Agric Food Chem，2006，54（1）：59-64.

[19]Antolovich M，Pernzler P，Robards K，et al.Sample preparation in the determination of phenolic compounds in fruits[J].Analyst，2000，125：989-1009.

[20]Cillers JJL，Singleton VL.Characterization of the products of nonenzymic autoxidative phenolic reaction in a caffeic acid modelsystem[J].J Agric Food Chem，1991，39（7）：1298-1303.

[21]鄧仕任，夏林波.響應面法優化芫花總黃酮的提取工藝[J].中國食品添加劑，2012（2）：70-76.

[22]陳莉，屠康，王海，等.采用響應面曲面法對采后紅富士蘋果熱處理條件的優化[J].農業工程學報，2006，22（2）：159-163.

Optimization of polyphenol extraction from navel orange peel by response surface methodology

QIN Yan1，FENG Wei-hua1，*，BAI Wei-dong1，2，TAN Xing-ting1，SHEN Peng1
（1.College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangdong Guangzhou 510225，China；2.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

TS201.2

B

1002-0306（2012）20-0231-06

2012-06-27 *通訊聯系人

秦艷（1986-），女，在讀研究生，研究方向：果蔬貯藏與加工、生物活性成分提取純化及功能分析。

廣東省教育部產學研結合項目（2010B090400257）；廣東省科技計劃農業攻關項目（2011A020202010）；廣東省科技計劃社會發展項目（2011B031000001）。