核桃蛋白肽脫苦及其對ACE抑制活性的影響

裴曉惠，張佳程，齊建勛，吳春林，陳永浩，*，郝艷賓，*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院，林業(yè)果樹研究所，北京 100093）

核桃蛋白肽脫苦及其對ACE抑制活性的影響

裴曉惠1，2，張佳程1，齊建勛2，吳春林2，陳永浩2，*，郝艷賓2，*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院，林業(yè)果樹研究所，北京 100093）

以核桃蛋白粕為原料采用堿溶酸沉法從中提取蛋白，用中性蛋白酶對其進(jìn)行酶解，制備核桃蛋白肽，采用活性炭和β-環(huán)狀糊精對核桃肽進(jìn)行脫苦，比較兩者脫苦效果以及脫苦對核桃蛋白肽ACE抑制率的影響。研究結(jié)果表明，活性炭脫苦時其影響因素排序為：活性炭用量＞處理時間＞pH，當(dāng)活性炭用量為50%，處理時間為100min，pH=8時，核桃蛋白肽苦味值最低，但其氮損失率較大；當(dāng)活性炭用量為40%，處理時間為80min，pH=7時氮損失量最低，苦味值為2，對ACE抑制活性影響較大，損失15.81%。β-環(huán)狀糊精脫苦最佳條件為β-環(huán)狀糊精添加量為22%，處理時間為30min，苦味值為2，對ACE抑制活性影響最小，僅降低了0.12%。β-環(huán)狀糊精處理是既能保存核桃蛋白肽ACE抑制活性，又能起到較好脫苦效果的脫苦處理方法。

脫苦，活性炭，β-環(huán)狀糊精，ACE抑制活性

Abstract：Protein was extracted from walnut residue and it was hydrolyzed by neutral protease.The determination of bitterness value was carried out to compare with the debittering effect for walnut peptides by using active carbon and β -cyclodextrin，and meanwhile to investigate their influences on the antihypertensive activity of walnut peptide，to choose a better way to debitterize.The result showed that the order of the influencing factors on debitterize：the amount of active carbon＞processing time＞pH.When the amount of active carbon was 50%，processing time was 100min，pH value was 8，the bitterness value of the peptide was lowest，while the nitrogen loss rate was larger.When the amount of active carbon got 40% ，processing time was 80min，pH value was 7，its minimum nitrogen loss rate was obtained，bitterness value of 2，and the loss of antihypertensive activity was 15.81%.The optimum condition to debitterize using β -cyclodextrin：the amount was 22% ，processing time was 30min.Under these conditions，the bitterness value could reduce to 2，the antihypertensive activity could hardly be affected.It was concluded that using β-cyclodextrin to debitterize was better than active carbon treatment.

Key words：debitterize；active carbon；β-cyclodextrin；ACE inhibitory activity

核桃營養(yǎng)豐富，核桃脂肪富含不飽和脂肪酸，且不含膽固醇[1]。核桃蛋白富含的18種氨基酸，8種人體必需氨基酸齊全，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白來源[2]。采用酶法將核桃蛋白水解后的酶解產(chǎn)物還具有降血壓和抗氧化等生理作用[3]，但經(jīng)酶解后蛋白的疏水性氨基酸暴露引起苦味卻限制了其在食品當(dāng)中的應(yīng)用[4]。因此要想擴大其應(yīng)用范圍，就要對其苦味進(jìn)行控制。目前常用的去除蛋白肽苦味的方法有3種：選擇性分離、酶脫苦法、掩蓋法。選擇性分離法脫苦主要是采用活性炭等吸附疏水氨基酸的同時亦可脫色，一舉兩得。但是會造成必需氨基酸的嚴(yán)重?fù)p失，使得氮元素含量降低，從而降低蛋白水解產(chǎn)物的營養(yǎng)價值[5]。酶法脫苦不會降低蛋白多肽的營養(yǎng)價值，但此方法將苦味肽進(jìn)一步水解，改變苦味短肽分子結(jié)構(gòu)，從而影響其功能性[4]，且成本較高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。掩蓋法脫苦是采用一些能掩蓋蛋白質(zhì)水解液苦味的物質(zhì)使蛋白酶解物苦味減輕[5]，不會影響蛋白肽功能性且易操作，但需要加入足夠量掩蓋劑才能夠掩蓋住肽的苦味，還可能會產(chǎn)生異味。本文主要采用活性炭吸附和β-環(huán)糊精掩蓋的方法脫除核桃蛋白多肽中的苦味，比較兩種方法對核桃多肽的苦味脫除效果及其對核桃多肽降血壓活性的影響，從中選擇一種較為合適的脫苦方法應(yīng)用于生產(chǎn)食品用核桃多肽，可提高食品的營養(yǎng)價值和功能性，滿足人們?nèi)找嬖鲩L的健康需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃蛋白粉 實驗室采用堿溶酸沉法從核桃蛋白粕中提取制得；中性蛋白酶 生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；活性炭 分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；β-環(huán)狀糊精 生化試劑，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、馬尿酰組胺酰亮氨酸（Hippuryl-His-Leuacetate salt，HHL） 美國Sigma公司。

PHS-3C型數(shù)字酸度計 上海鵬順科學(xué)儀器有限公司；HW·SY型電熱恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表有限公司；KDY-9830型凱氏定氮儀 北京市通潤源機電技術(shù)有限責(zé)任公司；UV-2102PC型紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃蛋白肽粉的制備[6]配制5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的核桃蛋白溶液，攪勻，放入90℃水浴鍋中加熱15min，使蛋白變性，調(diào)節(jié)pH至7.5，加入3%（占底物百分?jǐn)?shù)）的中性蛋白酶，將反應(yīng)液置于40℃恒溫水浴鍋中。在反應(yīng)過程中，用NaOH溶液不斷滴定，使反應(yīng)液保持pH=7.5。酶解5h后取樣，并將反應(yīng)液放入100℃水浴鍋中10min，滅酶。冷卻后調(diào)pH=4.5，在3200r/min離心5min，取上清液，調(diào)pH=7.0，最后將上清液冷凍干燥后備用。

1.2.2 苦味、酸味的評價方法 苦味的評價方法采用感官評定法[7]，配制20%、40%、60%、80%、100%的未脫苦的活性肽溶液，將其苦味值分別定義為1-無苦味，2-略有苦味，3-苦味較弱，4-苦味一般，5-苦味較重。根據(jù)此評分標(biāo)準(zhǔn)，將脫苦的活性肽溶液提供給10名品嘗者品嘗，并與標(biāo)準(zhǔn)未脫苦的核桃肽溶液比較進(jìn)行評分，最后得出平均值來表示苦味程度。酸味的評價方法[8]：0-無酸味，1-略有酸味，2-酸味較弱，3-酸味一般，4-酸味較重，5-酸味極重。

1.2.3 苦味的去除

1.2.3.1 活性炭脫苦單因素實驗 在使用活性炭前，先置于120℃的烘箱中活化4h以上。

a.活性炭用量和時間對活性炭脫苦的影響：分別稱取5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%（按占溶液中核桃多肽百分量計）活性炭于pH=7，濃度1%核桃肽溶液中，40℃水浴，每隔20min取50mL，取5次，采用感官評價法評價其苦味。

b．pH對活性炭脫苦的影響：分別量取50mL濃度1%核桃多肽溶液于8個100mL燒杯中，調(diào)其pH為3、4、5、6、7、8、9、10，再稱取40%的活性炭于8個燒杯中，40℃水浴80min，取出，采用感官評價法評價其苦味。

1.2.3.2 活性炭脫苦正交實驗 考慮到各因素間可能的相互依賴和相互制約，會對活性炭脫苦造成一定的影響，為得到理想的脫苦效果，通過正交實驗確定各參數(shù)的最佳組合。實驗以L9（33）正交表設(shè)計，3個因素分別為單因素實驗中所研究的活性炭用量、處理時間、pH，水平設(shè)計以單因素實驗的結(jié)果為基礎(chǔ)，見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.3.3 β-環(huán)狀糊精脫苦 分別將2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%的β-環(huán)狀糊精（按占溶液中核桃多肽百分量計）溶于1%的核桃多肽溶液中，置于40℃水浴中，每隔10min取出50mL，取8次，采用感官評價法評價其苦味。

1.2.4 氮含量的測定 采用全自動凱氏定氮儀測定氮含量，氮損失率按下式計算。

氮損失率（%）=[（核桃肽原液含氮量-活性炭處理樣液含氮量）/核桃多肽原液含氮量]×100

1.2.5 降血壓活性的測定 采用ACE抑制率的體外檢測方法[9]。

2 結(jié)果與討論

未脫苦的核桃多肽原液的苦味值為5，分別采用活性炭吸附和β-環(huán)狀糊精掩蓋2種方法進(jìn)行脫苦實驗。

2.1 活性炭脫苦

2.1.1 活性炭添加量對活性炭脫苦的影響 由圖1可知，活性炭吸附能力飽和之前，活性炭添加量越大，核桃蛋白酶解物苦味值就越低。在添加量為35%時，苦味值為2，明顯降低。這就表明，活性炭對核桃蛋白肽有明顯脫苦效果。在添加量達(dá)50%時，苦味值降為1，基本無苦味。考慮到活性炭吸附核桃多肽中疏水性基團(tuán)使得苦味降低同時營養(yǎng)價值也會大幅度下降，因此活性炭添加量不宜過多。

圖1 活性炭添加量對活性炭脫苦的影響Fig.1 Effect of the amount of active carbon on debitterize

2.1.2 脫苦時間對活性炭脫苦的影響 由圖2可見，活性炭脫苦時間越長，核桃蛋白肽苦味就越弱。吸附40min后，苦味值變化不明顯，下降趨勢減緩，說明此時活性炭吸附能力幾乎飽和。

圖2 脫苦時間對活性炭脫苦的影響Fig.2 Effect of the processing time of active carbon on debitterize

2.1.3 pH對活性炭脫苦的影響 酶解反應(yīng)體系的pH對活性炭脫苦效果也有一定的影響，pH較低時，由于酸的加入，掩蓋了苦味的同時帶來了明顯酸味，同樣不能被人群所接受，pH較高時，由于引入大量鈉離子，咸味增加。由圖3可知，pH在3～5之間時，酶解物苦味值最低為1，基本感受不到苦味，但在此范圍內(nèi)，由于檸檬酸而引起的酸味明顯，均在2以上，不能被正常人群所接受。pH在6～9之間時，酸味降低，pH=8時苦味值最低。pH=9時由于鈉離子濃度的增加，咸味增加，影響核桃蛋白肽的口感。因此pH=8時活性炭脫苦效果最佳，在此條件下無酸味，苦味值也低于2。

圖3 pH對活性炭脫苦的影響Fig.3 Effect of the pH on debitterize

2.1.4 活性炭脫苦正交實驗 活性炭吸咐脫除蛋白水解物中苦味的同時還具有脫色脫臭的效果，可謂一舉多得，但此方法有一最大的缺點就是活性炭脫苦同時吸附了疏水性氨基酸與疏水性短肽，使得苦味消失的同時營養(yǎng)價值下降[10]。從表2極差值可知，對活性炭脫苦及氮損失量影響因素的排序為：C（活性炭用量）＞B（處理時間）＞A（pH）。由此可見，活性炭用量不但對苦味影響最大，對氮損失量影響也最大，即活性炭用量越大，酶解物苦味值就越低，氮損失量也越大。損失的這部分氮就來自于被吸附的疏水性氨基酸和短肽。由表2可知，活性炭脫苦使得苦味最低的最佳組合為：活性炭用量為50%，脫苦時間為100min，pH=8，此條件下苦味可低于正交實驗中的最低苦味值1，基本無苦味。但由于活性炭用量對氮損失量影響也最大，因此此條件不可選。當(dāng)活性炭用量為40%，脫苦時間為80min，pH=7時氮損失量最低，低于正交實驗中氮損失率最低值2.790%，經(jīng)驗證，此條件下，苦味值為2，略有苦味，氮損失率為2.610%。因此活性炭脫苦最佳組合為活性炭用量為40%，脫苦時間為80min，pH為7。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal tests

2.2 β-環(huán)狀糊精脫苦

2.2.1 β-環(huán)狀糊精的包埋時間對脫苦的影響 由于在室溫下，β-環(huán)狀糊精溶解度較低為1.85%。隨溫度升高其溶解度增大，但是脫苦采用的溫度過高也有可能會影響核桃蛋白酶解物的性質(zhì)，因此包埋溫度選為40℃，由圖4可知，在30min內(nèi)，β-環(huán)狀糊精添加量越大，苦味值降低的速度就越快。包埋30min后不論β-環(huán)狀糊精添加量多少，苦味值變化均不明顯，說明β-環(huán)狀糊精在包埋30min后幾乎可以達(dá)到飽和，因此選定最佳包埋時間為30min。

圖4 β-環(huán)狀糊精包埋時間對脫苦的影響Fig.4 Effect of the processing time of β-cyclodextrin on debitterize

2.2.2 β-環(huán)狀糊精的添加量對脫苦的影響 圖5說明了在一定量范圍內(nèi)隨著環(huán)狀糊精的添加量增加，酶解物苦味值下降，但當(dāng)添加量達(dá)到24%時，苦味基本無變化。由圖5可見，β-環(huán)狀糊精添加量過多對苦味幾乎無影響，但是由于β-環(huán)狀糊精溶解后黏稠，使得核桃多肽液感官品質(zhì)下降，產(chǎn)生異味，因此β-環(huán)狀糊精添加量不宜過多。

表3 脫苦對核桃蛋白酶解物降血壓活性的影響Table 3 Effect of debitterize on the ACE inhibitory activity

圖5 β-環(huán)狀糊精添加量對脫苦的影響Fig.5 Effect of the amount of β-cyclodextrin on debitterize

2.3 脫苦對核桃蛋白酶解物降血壓活性的影響

由以上實驗結(jié)果篩選出幾種脫苦效果的較佳實驗組合，來考察脫苦對核桃蛋白酶解物降血壓活性的影響。活性炭的脫苦效果要綜合考慮苦味降低程度和氮損失量兩個因素，得出最佳的組合為活性炭用量40%，脫苦時間80min，pH=7，苦味值為2，苦味不明顯，氮損失率低于2.790%。β-環(huán)狀糊精脫苦在其添加量達(dá)22%以上時，苦味值降低至2以下，苦味不明顯。因此選擇這幾種實驗組合來考察脫苦對核桃蛋白酶解物降血壓活性的影響，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，活性炭脫苦對ACE抑制率影響較大，明顯降低其抑制率，可見活性炭雖有好的脫苦效果，但其使酶解物營養(yǎng)價值降低的同時，又會降低酶解物降血壓的活性，因此不可取。β-環(huán)狀糊精脫苦對ACE抑制率也有一定影響，但影響較小，β-環(huán)狀糊精添加量越大，ACE抑制率越低。當(dāng)β-環(huán)狀糊精添加量為22%時，包埋30min，核桃蛋白酶解物苦味值降為2，ACE抑制率降低最少，為0.12%，當(dāng)β-環(huán)狀糊精添加量添加量為24%時苦味值達(dá)最低值1.5，ACE抑制率降低3.74%，也是可取的。β-環(huán)狀糊精添加量增加到26%時，ACE抑制率降低較多，這可能是由于β-環(huán)狀糊精是中空狀，可以與大小、性質(zhì)合適的小分子形成包合物。β-環(huán)狀糊精添加量多，分子與分子之間競爭，形成了更為穩(wěn)定的包合物，使得具有苦味的疏水性小分子肽更不易脫離。另外，β-環(huán)狀糊精由于其本身不會改變生物多肽的活性，脫苦之后又不用將其去除，而且還具有圓潤柔滑的口感，因此選用β-環(huán)狀糊精脫苦較好。

3 結(jié)論

本文采用了活性炭吸附和β-環(huán)狀糊精掩蓋兩種脫苦方法脫除核桃蛋白酶解物的苦味。活性炭脫苦，當(dāng)活性炭用量為50%，脫苦時間為100min，pH=8時可使苦味值小于1，效果雖好，但用其脫苦氮損失率較大，造成了酶解物營養(yǎng)價值的大幅度降低，活性炭用量為40%，脫苦時間為80min，pH=7時氮損失率最低，為2.610%，苦味值也不高為2，但在此條件下，酶解物的降血壓活性大大降低，故核桃蛋白酶解物不宜采用活性炭脫苦。而采用β-環(huán)狀糊精脫苦，效果雖不及活性炭，但當(dāng)其添加量達(dá)24%以上時苦味值可低至1.5，基本無苦味，對酶解物的降血壓活性影響也較小。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)β-環(huán)狀糊精的添加量為22%時苦味值為2，降血壓活性僅降低0.12%，當(dāng)β-環(huán)狀糊精添加量為24%時苦味值降至1.5，降血壓活性降低3.74%。β-環(huán)狀糊精不但價格低廉易得，具有圓潤柔滑的口感，且不會影響核桃蛋白酶解物的營養(yǎng)價值。由此可見，β-環(huán)狀糊精脫苦是核桃蛋白酶解物進(jìn)行脫苦的最佳途徑。

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Debittering of walnut peptide and the effect of ACE inhibitory activity

PEI Xiao-hui1，2，ZHANG Jia-cheng1，QI Jian-xun2，WU Chun-lin2，CHEN Yong-hao2，*，HAO Yan-bin2，*
（1.School of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Institute of Forestry&Pomology，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science，Beijing 100093，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）20-0236-04

2012-03-31 *通訊聯(lián)系人

裴曉惠（1987-），女，碩士，研究方向：功能活性成分研究。