基于“方證相應(yīng)”理論驗證慢性間歇性缺氧模型氣陰兩虛證候?qū)傩缘某醪窖芯?

王文萍，柴程芝，寇俊萍，朱丹妮，嚴(yán)永清，余伯陽

（中國藥科大學(xué)中藥復(fù)方研究室，南京 211198）

氣陰兩虛證是臨床常見證型，可見于多種急性熱病后期與各種慢性內(nèi)傷雜病之中［1］，以形體消瘦、食欲不振、體倦乏力、煩躁、心悸、脈細(xì)數(shù)等表現(xiàn)為主要臨床特征［2］。到目前為止，尚缺乏成熟的可供臨床及藥理學(xué)研究的理想的氣陰兩虛證動物模型［3］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，不同缺氧方式均能夠誘導(dǎo)慢性間歇性缺氧小鼠表現(xiàn)為：體重下降，攝食量減少、自發(fā)活動改變、心率加快、T波持續(xù)性升高等心電圖異常改變以及斷尾出血時間縮短，不僅驗證了采用慢性間歇性缺氧為手段構(gòu)建氣陰兩虛證動物模型的可行性，而且體現(xiàn)了由虛到瘀的病機(jī)演變過程，符合氣陰兩虛證的臨床病機(jī)演變規(guī)律［4、5］。本研究依據(jù)“方證相應(yīng)”理論，擬采用益氣養(yǎng)陰的代表方生脈散干預(yù)，考察其對慢性間歇性缺氧模型模擬氣陰兩虛證的各項指標(biāo)的改善程度，從“以方測證”的角度進(jìn)一步驗證模型的氣陰兩虛證候?qū)傩裕疾炷Ｐ团c氣陰兩虛證的相關(guān)性。

1 材料

1.1 藥物及試劑

本研究所用的紅參、麥冬、五味子飲片均購自南京傳統(tǒng)中醫(yī)門診部，并由中國藥科大學(xué)余伯陽教授鑒定，符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)；鈉石灰由上海陸都化學(xué)試劑廠生產(chǎn)（批號20090120）。

1.2 藥物制備

將紅參、麥冬、五味子 3味藥剪碎，按照 1∶3∶1.5比例混勻后，用單蒸水浸泡30min，分別加10倍、8倍、6倍單蒸水分別煎煮 60min后過濾，將濾液合并，水浴濃縮至濃度為0.55g/ml備用。

1.3 動物

ICR小鼠雄性，體重 18 g ～22 g，SPF級，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)動物中心提供（動物合格證號SCXK（蘇）2007-0001）。

1.4 儀器

低壓氧全自動控制儀（簡稱低壓氧儀，南京新飛分析儀器制造有限公司，型號 XF-YC06）；心電圖機(jī)（日本光電工業(yè)株式會社，型號 EGG-6511）。

2 方法

2.1 造模方法 30只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組和生脈散組，每組10只飼養(yǎng)于同一籠內(nèi)，每籠小鼠每天給定量食物100 g，自由飲水。空白組每天正常喂養(yǎng)，早晨灌服生理鹽水0.2ml/10g；模型組每晚9點開始禁食，次晨8點放入低壓氧儀缺氧箱中，將氧分壓調(diào)至 7％ ～8％，持續(xù)缺氧 20min，每天1次，連續(xù)42 d；生脈散組在每天缺氧前30min灌服生脈散水提液0.2ml/10g體重，其余處理與模型組相同。

2.2 觀測指標(biāo)

2.2.1 體重 分別于實驗第 1、7、14、21、28、35、42天早晨9時供給食物前，分別稱體重并作記錄。

2.2.2 攝食量 分別于實驗第 1、7、14、21、28、35、42天晚間 9時禁食前稱剩余食物量并作記錄。

2.2.3 自發(fā)活動 分別于實驗第 1、7、14、21、28、35、42天上午9時，采用新型開場系統(tǒng)考察各組的自發(fā)活動［6］，包括：①運(yùn)動力，即行走格數(shù)：觀察2min內(nèi)小鼠四肢所爬過的格子數(shù)；②直立數(shù)：觀察2min內(nèi)后肢站立，前肢離地1cm以上的次數(shù)。開場實驗箱為直徑30cm圓形場地，高20cm，有2個同心圓分為外側(cè)、中間及中心區(qū)域，試驗在暗室、安靜的環(huán)境中進(jìn)行。

2.2.4 心電圖 于實驗第 1、7、14、21、28、35、42天上午10時，用4％水合氯醛0.1ml/10g腹腔注射麻醉后30min測心電圖，記錄心率及 T波變化。

2.2.5 斷尾出血時間 依據(jù) Dejana等報道的方法［7］，于試驗第43天上午 9時將小鼠固定，以毫米尺測量鼠尾長度并標(biāo)記后以手術(shù)剪在尾端5 mm處剪斷，之后將斷尾立即浸入37℃的生理鹽水中，記錄出血時間。以出血停止60 s作為出血時間。

2.3 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果均用 珋x±s表示。利用 SPSS 17.0軟件的重復(fù)測量方差分析分析各組間體重、進(jìn)食量、自發(fā)活動、心電圖 T波、心率之間的差異。用單因素方差分析檢驗各組出血時間的差異，以 P＜0.05為統(tǒng)計顯著性水平。

3 結(jié)果

3.1 各組間體重比較

圖1顯示，空白對照組體重呈逐漸增長趨勢，模型組的體重增長緩慢，并且從第14天開始呈下降趨勢，第21天到第42天與空白對照組比較均有極顯著差異（P＜0.05）。與模型組相比較，生脈散組的體重一直呈增長趨勢，與空白對照組保持一致，并且從第28天到第42天與模型組比較有極顯著差異（P ＜0.01）。

3.2 各組間攝食量比較

圖2顯示了各組隨著不同缺氧時程的進(jìn)食量變化趨勢。模型組小鼠的進(jìn)食量在前2周明顯下降，從第3周開始一直保持在較低水平，與空白對照組比較有極顯著差異（P＜0.01）。生脈散組的攝食量在第1周有所下降，從第2周開始明顯上升，與模型組相比較有極顯著差異（P＜0.01）。

圖1 生脈散對缺氧小鼠體重影響的經(jīng)時變化

圖2 生脈散對缺氧小鼠攝食量影響的經(jīng)時變化

3.3 各組間自發(fā)活動比較

圖3和圖4分別顯示了各組在不同時間的行走格數(shù)與直立次數(shù)。數(shù)據(jù)顯示，模型組前2周的行走格數(shù)明顯減少，隨著缺氧時間的延長，從第14天開始逐漸增多并一直保持上升趨勢；直立次數(shù)則一直呈逐漸上升的趨勢，與空白對照組比較有極顯著差異（P＜0.01）。與模型組相比較，生脈散組的行走格數(shù)與直立次數(shù)隨著時間的延長基本處于穩(wěn)定水平，與模型組比較有極顯著差異（P＜0.01）。

圖3 生脈散對缺氧小鼠行走格數(shù)影響的經(jīng)時變化

3.4 各組間心電圖比較

研究結(jié)果表明，與空白對照組相比較，模型組前4周的心率呈逐漸加快趨勢（圖5），T波隨缺氧時間的延長一直呈逐漸抬高趨勢（圖6），與空白對照組比較有極顯著差異（P＜0.01）。與模型組相比較，生脈散組的心率與T波基本平穩(wěn)，在第14天、第28天與第28天、第42天與模型組相比有極顯著差異（P ＜0.01）。

3.5 斷尾出血時間

圖4 生脈散對缺氧小鼠直立次數(shù)影響的經(jīng)時變化

圖5 生脈散對缺氧小鼠心率影響的經(jīng)時變化

圖6 生脈散對缺氧小鼠T波影響的經(jīng)時變化

表1顯示了空白對照組與模型組在實驗第43天通過剪尾法測得的出血時間。與空白對照組比較，模型組的出血時間明顯縮短，與空白對照組比較差異顯著（P＜0.05）。與模型組比較，生脈散組的出血時間延長，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異（P＞0.05）。

4 討論

辨證論治是中醫(yī)學(xué)的診療特點與優(yōu)勢特色，“以方測證”是基于辨證論治的原則下，根據(jù)“有是證，用是方”的對應(yīng)關(guān)系而提出的一種研究方法，該方法在上個世紀(jì)就被引入證候模型研究中并得到廣泛應(yīng)用［8～12］。本研究在慢性間歇性缺氧小鼠的表觀行為特征能夠部分模擬氣陰兩虛證主要臨床特征的基礎(chǔ)上，考察了益氣養(yǎng)陰的代表方生脈散對模型干預(yù)后各項指標(biāo)的變化，進(jìn)一步從“以方測證”角度驗證模型的證候?qū)傩浴Ｑ芯拷Y(jié)果顯示，生脈散能顯著改善慢性間歇性缺氧誘導(dǎo)的小鼠體重，攝食量，自發(fā)活動，心電圖等各項指標(biāo)的異常改變，使小鼠體重及攝食量增加，自發(fā)活動和心率趨于穩(wěn)定，T波隨缺氧時間的延長無顯著增高，斷尾出血時間較模型組延長。在模擬氣陰兩虛證臨床特征的各項指標(biāo)中，對模擬食欲不振、體倦乏力、煩躁、心悸、脈細(xì)數(shù)的攝食量減少，行走格數(shù)減少、直立次數(shù)增加、心率加快、T波抬高等指標(biāo)的改善尤其明顯，與模型組比較有極顯著差異。曲線下面積（AUC）也顯示，生脈散干預(yù)組各項指標(biāo)隨時間變化趨勢與空白對照組基本一致，二者比較無顯著性差異［13］，初步證實了模型與生脈散主治氣陰兩虛證的相關(guān)性。

表1 生脈散對慢性間歇性缺氧小鼠斷尾出血時間的影響

“以方測證”法雖然在某種程度上能夠說明方所主治證與模型的相關(guān)性，但并不是驗證模型證候?qū)傩缘某浞謼l件［14、15］。因此，關(guān)于慢性間歇性缺氧模型的氣陰兩虛證候?qū)傩则炞C，還需要通過其他氣陰兩虛證類方驗證，不同方劑反證以及與表觀行為指征相關(guān)的藥效學(xué)指標(biāo)驗證等方法尚需進(jìn)一步完善。

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