胸腺素原體內抑制小鼠肝癌細胞H22的研究①

蔡報偉 栗 華 韓 偉 王世媛 張 亭 劉升發 周克夫

(廈門大學生命科學學院環境與生態學院細胞生物學和腫瘤細胞工程教育部重點實驗室，廈門361005)

根據Parkin等［1］報道，2000年全球新發癌癥病例為1 010萬例，死亡620萬。在 Ferlay等［2］報道中最常見的癌癥中致死率排列第三是肝癌。在我國肝癌的死亡率占全部惡性腫瘤死亡的18.8%，僅次于胃癌［3］。因此，尋找和篩選有效的抗肝癌藥物是目前醫學界研究的熱點。

胸腺素α原(Prothymosinα，ProTα)是胸腺素α1(Tα1)的前體蛋白，在哺乳動物細胞中廣泛分布，在淋巴組織及非淋巴組織均可找到。在細胞外，ProTα通過潛在的膜受體調節免疫應答，促進IFN-γ、TNF-α、IL-2等細胞因子的產生，進而增強細胞和體液免疫應答。研究表明，ProTα能夠有效抑制腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的壽命［4］。本研究開展從中國健康人外周血淋巴細胞克隆表達的重組人ProTα對抑制小鼠肝癌細胞株H22的體內研究，為今后開展腫瘤藥物的研究和應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 H22腫瘤株(小鼠肝癌)由廈門大學醫學院實驗動物中心保種。實驗動物為雄性昆明小鼠，SPF級，購自廈門大學醫學院實驗動物中心。重組人前胸腺α原由本實驗室和廈門伯賽基因轉錄技術有限公司共同制備。

1.2 方法

1.2.1 重組ProTα干預 將小鼠隨機分為A、B、C、D、E組，每組各5只，A組預先腹腔注射等體積的生理鹽水作為空白對照組，B組預先腹腔注射ProTα，7.5 ng/g;C組預先腹腔注射ProTα，12.5 ng/g;D組預先腹腔注射ProTα，25 ng/g;E組預先腹腔注射 ProTα，50 ng/g。共預先腹腔注射9次，隔一天注射一次。

1.2.2 H22腹水型荷瘤小鼠模型制備 無菌條件下將購買的H22腹水腫瘤按1∶8稀釋計數，然后調整濃度為 3 ×107ml－1，以 100 μl/只，每只接種 H22的細胞數為3×106個/只，接種于小鼠的腹腔，觀察并記錄小鼠的存活情況，隔天記錄小鼠體重。

1.3 統計學處理 記錄各組死亡時間，數量，根據數據，采用 GraphPad Prism5軟件進行統計分析。P＜0.05為顯著差異，P＜0.01為極顯著差異。

2 結果

2.1 預先用藥組和對照組小鼠的存活情況差異比較 經過觀察記錄，A對照組小鼠在腹腔注射H22后第13天開始出現死亡 ，第22天全部死亡，而用藥組B組，第20天才開始出現死亡，到第34天才最后全部死亡;C、D、E組分別是30、31、34天全部死亡，結果說明ProTα對H22腫瘤具有明顯抑制效果。

圖1可以看出A組和B組平均生存時間有顯著性差異(P＜0.05)，相對于A組，B組小鼠平均生命明顯延長，C組、D組、E組的平均生存時間也較A組要長，但延長時間沒有明顯的差異(P＞0.05)，所以我們可以得出ProTα用藥量為7.5 ng/g時效果最明顯。

2.2 預先用藥各組和對照組小鼠的體重變化比較

各組小鼠接種H22后，體重隨時間變化情況見表1。從表1中我們可以看出用藥組B體重在第5～7天開始明顯比對照組A小，差異顯著(P＜0.05)，第9天后，B、C、D組和對照組出現了極顯著性差異(P＜0.01)，而E組和對照組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。此外，我們發現ProTα的用藥量在7.5～12.5 ng/g時，對本實驗小鼠腹水抑制作用效果更明顯。

圖1 各組小鼠平均存活天數Fig.1 The average survival time of mice in each group

表1 不同時間各組小鼠平均體重差異情況Tab.1 The average body weight of mice in each group at different times

3 討論

有研究報道外源注射重組ProTα可以有效提高免疫系統的免疫能力［5］。注射ProTα會增強小鼠體液免疫和細胞免疫［6］。已經被證明大鼠的ProTα在小鼠感染Candida albicans后具有免疫保護作用［7］。Pan等［8］認為這種免疫保護作用和生物體釋放遷移抑制因子(MIF)有關，ProTα能刺激單核細胞釋放轉移抑制因子(MIF)，其作用比Thymosinα1強10～20倍。胸腺素α原可以明顯延長大部分白血病模型DBA/2小鼠的存活期，對小鼠進行腹腔注射胸腺素α原后，具有能夠增強腹膜內巨噬細胞的殺瘤作用，提高NK細胞、LAK細胞的活性，并誘導IL-2和TNF-α的產生，因此能夠在免疫防御反應中起關鍵性的作用［9］;同時胸腺素α原激活腫瘤特異性細胞毒T細胞(CD8+)和輔助性T細胞(CD4+)的特異性抗腫瘤作用，有利于延長患有腫瘤的小鼠壽命［10，11］。Skopeliti等［12］最近發現，在凋亡細胞中，胸腺素α原被caspases切割產生的多個C末端的片段，具有刺激外周血單核細胞增殖、自體混合淋巴細胞反應、自然殺傷(NK)淋巴因子激活的殺傷細胞活性，促使胞內穿孔素產生，上調粘附分子和CD25的表達以及淋巴細胞活化等免疫調節活性。

我們通過原核表達獲得高純度的重組ProTα，經過體內實驗證明具備天然 ProTα的生物活性［13，14］。本研究以小鼠肝癌細胞株為對象，研究該重組ProTα對腹水型H22的抑制效果。通過體內抑制腫瘤實驗，證明該重組蛋白能夠有效抑制小鼠H22細胞在體內繁殖，減少腹水含量，降低小鼠癥狀，明顯延長小鼠生存時間，其中重組蛋白劑量在7.5 ng/g時效果最明顯。這個結果與文獻報道的結果一致［15］。通過探究該重組蛋白的體內生物活性，為今后開展抗腫瘤藥物篩選提供新的途徑。有關該重組ProTα的抑制腫瘤生長的生物活性機理目前正在研究中。

1 Parkin D M，Bray F，Ferlay J et al.Estimating the world cancer burden:Globocan 2000［J］.Intern J Cancer，2001;94:153-156.

2 Ferlay J，Shin H R，Bray F et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008［J］.Int J Cancer，2010;127:2893-2917.

3 Jemal A，Siegel R，Xu J et al.Cancer statistics，2010［J］.CA Cancer J Clin，2010;60:277-300.

4 Pineiro A，Cordero O J，Nogueira M.Fifteen years of prothymosin alpha:contradictory past and new horizons［J］.Peptides，2000;21:1433-1446.

5 Maric D，Jankovic B D，Veljic J.Immunostimulatory activity of prothymosin-alpha in senescence［J］.Ann NY Acad Sci，1991;621:148-158.

6 Maric D，Veljic J，Ranin J et al.In vivo effect of prothymosin-alpha 1 on humoral and cell-mediated immune responses in the young rat［J］．Int J Neurosci，1991;59:135-142.

7 Haritos A，Salvin S，Blacher R et al.Parathymosin alpha:a peptide from rat tissues with structural homology to prothymosin alpha［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1985;82:1050-1053.

8 Pan L X，Haritos A A，Wideman J et al.Human prothymosin alpha:amino acid sequence and immunologic properties［J］.Arch Biochem Biophys，1986;250:197-201，1050-1053.

9 Yang C H，Murti A，Baker S J et al.Interferon induces the interaction of prothymosin-alpha with STAT3 and results in the nuclear translocation of the complex［J］.Exp Cell Res，2004;298:197-206.

10 Baxevanis C N，Gritzapis A D，Spanakos G et al.Induction of tumorspecific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha［J］.Cancer Immunol Immunother，1995;40:410-418.

11 Baxevanis C N，Gritzapis A D，Dedoussis G V et al.Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha［J］．Cancer Immunol Immunother，1994;38:281-286.

12 Skopeliti M，Voutsas I F，Klimentzou P et al.The immunologically active site of prothymosin α is located at the carboxy-terminus of the polypeptide.Evaluation of its in vitro effects in cancer patients［J］．Cancer Immunol Immunother，2006;55:1247-1257.

13 李俊燕，周克夫.前胸腺素α原基因的克隆及在大腸桿菌中的融合表達［J］.廈門大學學報(自然科學版)，2006;45(5):722-725.

14 高吉清，劉升發，周克夫.重組人前胸腺素α原在瘧原蟲疫苗佐劑中的作用研究［J］.中國免疫學雜志，2011;27(6):552-555.

15 Papanastasiou M，Baxevanis C N，Papamichail M.Promotion of murine antitumor activity by prothymosin alpha treatment(I):Induction of tumoricidal peritoneal cells producing high levels of tumour necrosis factor alpha［J］.Cancer Immunol Immunother，1992;35:145-150.