超高效液相色譜質譜法快速檢測動物源性食品中的四種獸藥殘留

沙美蘭，曹 鵬，2，*，李金強，王倩倩，關麗麗，牟 妍

（1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺 264000；2.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018）

超高效液相色譜質譜法快速檢測動物源性食品中的四種獸藥殘留

沙美蘭1，曹 鵬1，2，*，李金強1，王倩倩1，關麗麗1，牟 妍1

（1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺 264000；2.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018）

建立了采用超高效液相色譜串聯質譜儀快速檢測動物組織中甲氧芐胺嘧啶、克林霉素、泰妙菌素和吡喹酮四種藥物殘留的分析方法。動物組織樣品經乙腈提取后，用正己烷去除脂肪等雜質，Waters Acquily UPLC BEH C18色譜柱分離，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，電噴霧正離子（ESI+）模式電離，液相色譜-質譜法（UPLCMS/MS）測定。結果表明：4種藥物在2.5～200μg/L范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R2均大于0.996，在此范圍內添加回收率為65.8%～95.9%，相對標準偏差為3.2%～13.1%，定量下限為0.5μg/kg。

超高效液相色譜串聯質譜，甲氧芐胺嘧啶，克林霉素，泰妙菌素，吡喹酮，動物源性食品

Abstract：An ultra performance liquid chromatography coulped to tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）method was established for the determination of trimethoprim，clindymycin，tiamulin and praziquantel residues in animal origin food．The sample was extracted with acetonitrile，purified by hexane，and detected on Waters Acquity UPLC BEH C18column by a gradient elution using acetonitrile（A）—0.1%formic acid（B） as mobile phase with a flow rate of 0.3mL/min．The calibration curves were good linear between the peak areas and concentrations of 4 veterinaries in the range of 2.5～200μg/L，with correlation coefficients more than 0.996．The average recoveries at this concentration levels ranged from 65.8%to 95.9%，the RSD was in the range of 3.2%～13.1%.The limits of quantification of 4 drugs in animal origin food were 0.5μg/kg.

Key words：UPLC-MS/MS；trimethoprim；clindymycin；tiamulin；praziquantel；animal original foods

最近，隨著食品安全事件的頻繁出現，人們對食品安全也愈發的重視，雖然國家對相關藥物做了規范，但是在利益的驅使下，還是有不少濫用抗生素的現象。甲氧芐胺嘧啶、泰妙菌素、吡喹酮和克林霉素這四種藥物作為抗生素和抗菌素因其特有的效果，目前已經被廣泛應用于畜禽類和水產品的養殖中，主要用于防治呼吸系統疾病和寄生蟲疾病中等。但是，人們長期食用含有這些藥物殘留的食物，會對身體健康帶來很大的安全隱患。2010年6月，韓國增加針對水產品的檢測項目，新增抗生素類中就包括甲氧芐胺嘧啶（trimethoprim）、克林霉素（clindymycin）、泰妙菌素（tiamulin）、吡喹酮（praziquantel），在魚類或甲殼類中的限量分別為0.05、0.1、0.1、0.02mg/kg。目前，除了泰妙菌素，其他3種藥物分別有相應的國家標準和行業標準[1-3]，但是每個項目均為獨立的前處理方法和儀器檢測方法，并且很多文獻報道也僅是局限于一種藥物在各種基質中的檢測，主要是液相色譜法[4-9]和液相色譜—質譜法[10-14]，不能同時、快速的進行分析檢測。本實驗針對這4種常見藥物建立了一種快速、簡便、靈敏度高、專屬性強的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）方法，對人們的身體健康和控制產品質量具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲氧芐胺嘧啶（CAS：738-70-5，99.5%）、泰妙菌素（CAS：55297-95-5，98.5%）、克林霉素（CAS：18323-44-9，99.0%）、吡喹酮（CAS：55268-74-1，99.0%） 均購自德國Dr.Ehrenstorfer；乙腈、甲醇、正己烷 德國默克公司，色譜純；水 為超純水；硫酸鈉（分析純）、甲酸（色譜純）、乙酸銨（色譜純） 天津科密歐化學試劑有限公司。

Waters Acquity UPLC-Quattro Premier XE，配有電噴霧離子源（ESI）及MassLynx V4.1數據處理系統美國Waters公司；旋轉蒸發儀 瑞士BUCHI；超純水儀 美國Millipore公司；DL-5C離心機 上海安亭科學儀器廠；FJ200-9均質器 上海標本模型廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 雞肉、豬肉、石鰈魚、雪蟹取可食用部分用食品攪拌機制成均勻樣品，冷凍保存，備用。

1.2.2 標準儲備溶液喹酮的配制 分別稱取0.0100g標準物質，用乙腈配制成100mg/L的標準儲備液，4℃避光保存。

1.2.3 混合標準溶液的配制 準確移取一定量的標準儲備液置于容量瓶中，用乙腈與水混合溶液（4∶6，V/V）稀釋成適當濃度的標準工作液并定容至刻度線，4℃避光保存。

1.2.4 樣品處理 準確稱取5.0g（精確至0.01）均質樣品、5g無水硫酸鈉，置于50mL離心管中，加入20mL乙腈，振蕩提取，5000r/min離心5min，上清液轉移至125mL分液漏斗中，殘渣中加入15mL乙腈，再次提取1次，合并上清液至分液漏斗中。向分液漏斗中加入20mL乙腈飽和的正己烷，振蕩搖勻，靜置分層，取下層乙腈至雞心瓶中。40℃水浴條件下旋轉蒸發至干，準確加入1mL乙腈/水（4∶6，V/V）含0.1%的甲酸混合溶液，超聲使其完全溶解，將溶液轉移至2.0mL小離心管中，向其中再加入1mL乙腈飽和正己烷，12000r/min高速離心10min。吸下層過0.22μm的濾膜。

1.2.5 色譜、質譜條件

1.2.5.1 液相色譜條件色譜柱 Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動相：乙腈（A），0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～3min，10%A線性變化至90%A，3～4min，維持90%A，4～5min，維持10%A；流速：0.3mL/min；柱溫40℃；進樣量：2μL。

1.2.5.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI+）；毛細管電壓為3.0kV；源溫120℃；脫溶劑溫度為350℃；脫溶劑氣流速為600L/h；錐孔反吹氣流速為50L/h。多反應監測各離子對及各優化參數見表1。

表1 4種藥物的多反應監測質譜參數Table 1 MS parameters of MRM mode for 4 drugs

2 結果與討論

2.1 提取與凈化條件的優化

4種藥物均為極性物質，對提取液的選擇主要集中在乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙腈，經過一系列的實驗比較（圖1），發現用乙腈提取能滿足所有組分回收率在理想范圍內，且雜質干擾少，故本方法最終采用常用的試劑乙腈提取，同時達到沉淀蛋白的目的。

圖1 不同提取溶劑下回收率的比較Fig.1 The comparison of recovery with different extraction solvents

凈化方法的確定比較了固相萃取小柱和液液分配萃取兩種凈化方法。采用固相萃取柱對雞肉、豬肉等動物組織有明顯的提取凈化效果，但對粘稠性膠體狀復雜性樣品如魚、蝦等則存在易堵塞、不宜洗脫、操作繁瑣、成本較高等問題。本文旨在快速檢測，故舍棄固相萃取凈化的步驟，而采用正己烷與乙腈液液分配去除脂肪等雜質，定容后再用乙腈飽和正己烷去除油脂等大分子雜質，能有效地消除基質干擾，同時靈敏度也能滿足檢測需要，提高了工作效率，達到了快速檢測的目的。另外，在樣品提取過程中，加入無水硫酸鈉可以有效防止樣品中的水分及干擾成分進入提取液，同時硫酸鈉的存在可促使蛋白質變性分散，防止樣品形成塊狀影響提取效率。

2.2 定容液的優化

除了試劑要保證充分提取外，定容液也是一個重要的控制點。4種藥物中，除了甲氧芐胺嘧啶的極性較大外，其他3種均為弱極性藥物，要同時分析這4種藥物，并均獲得良好的回收率，首先采用了甲醇+水體系，分別為2+8，4+6，6+4，但這4種藥物均洗脫不充分，回收率比較低；之后改用乙腈+水體系，分別為2+8，4+6，6+4。結果表明，乙腈比例低，回收率低；乙腈比例高，甲氧芐胺嘧啶的峰形變差。最終選用乙腈+水（4+6）效果最好，每個組分的峰形和回收率都能達到滿意的結果。另外，由于甲氧芐氨嘧啶是強極性物質，含有電負性強的原子，在定容液中加入0.1%的甲酸（體積比），甲氧芐胺嘧啶的回收率有所提高，見圖2。

圖2 不同定容體系的回收率Fig.2 The recovery of different constant systems

2.3 色譜條件的優化

本實驗比較了Waters ACQUITY UPLC HSS T3Column（2.1mm×50mm，1.8μm）、Waters ACQUITY SHIELD RP18Column（2.1mm×50mm，1.7μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18Column（2.1mm×50mm，1.7μm）三種柱子，發現BEH C18對這4種藥物的保留性、靈敏度和峰形都表現出明顯的優勢。最終選擇以BEH C18色譜柱為分離柱。

采用乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，4種藥物均分離良好，峰形尖銳對稱，5min內就能完成一個樣品的檢測，且目標峰沒有基質干擾。

乙腈和水是實驗室常備試劑，省去了配制流動相的步驟，同時對柱子的損耗也比用鹽做流動相要小的多，同時也節省了沖洗柱子的時間，大大提高了工作效率。另外，已有研究表明，在流動相中加入甲酸有利于準分子離子的生成[15]，促進化合物的電離，提高靈敏度。

2.4 質譜條件的優化

實驗首先采用1mg/L各種藥物標準溶液，以蠕動泵進樣方式在電噴霧正離子模式下進行母離子全掃描，找出準確的分子離子作為母離子，然后以分子離子為母離子對其子離子進行全掃描，最后選取豐度較強的2個子離子，優化其錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數。選擇豐度較大并且響應穩定的來做定量離子。

2.5 線性范圍、標準曲線及定量下限

準確配制2.5、10、20、50、100、200μg/L的系列標準工液，從低濃度到高濃度依次進樣。以各藥物定量離子的質量色譜峰面積為縱坐標，質量濃度（μg/L）為橫坐標，繪制標準曲線，可以看出4種藥物在2.5～200μg/L范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R2均大于0.996，見表2。

表2 4種獸藥的線性范圍、線性方程及相關系數Table 2 Linear ranges，regression equation and related coefficient for 4 drugs

采用空白組織中添加目標化合物的方法，根據特征離子質量色譜峰信噪比S/N≥10為方法定量下限，得出4種藥物在樣品（豬肉、雞肉、石鰈魚、雪蟹）中的定量下限均為0.5μg/kg。空白雞肉中添加4種2.5μg/kg標準溶液的特征離子質量色譜圖見圖3。

圖3 雞肉樣品空白與添加標準品回收的質量色譜圖Fig.3 MRM spectra of blank sample of chicken and blank chicken sample with addition of the 4 drugs

表3 添加回收率的結果（n=5）Table 3 Results of recovery（n=5）

2.6 回收率與重復性

分別對四種基質（豬肉、雞肉、石鰈魚、雪蟹）的樣品進行了3個水平（0.5、2、10μg/kg）的添加回收實驗，每一添加水平重復5次。結果表明，4種藥物在空白樣品中的平均加標回收率在65.8%～95.9%，相對標準偏差為3.2%～13.1%。符合殘留檢測方法對回收率與精密度的要求。回收率和相對標準偏差見表3。

3 結論

通過對樣品前處理條件的優化和改進，建立了以雞肉、豬肉、石鰈魚和雪蟹為代表的動物源性食品中4種常見藥物殘留檢測的UPLC-MS/MS方法。該法前處理簡單易操作，分析時間短，5min就能完成一個樣品的檢測，并且線性范圍寬，靈敏度高，檢測結果準確，定量限（LOQ）可達到0.5μg/kg，能滿足獸藥殘留高通量分析的要求。

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Rapid determination of four veterinary drugs residue in animal products by UPLC-MS/MS

SHA Mei-lan1，CAO Peng1，2，*，LI Jin-qiang1，WANG Qian-qian1，GUAN Li-li1，MU Yan1
（1.Yantai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai 264000，China；2.College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

TS207.5+3

A

1002-0306（2012）16-0082-04

2011－12－26 *通訊聯系人

沙美蘭（1981-），女，助理工程師，研究方向：獸殘檢測。