響應面法優化小球藻培養基

葛珍珍，王 杰，周燦燦，余曉斌

（江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

響應面法優化小球藻培養基

葛珍珍，王 杰，周燦燦，余曉斌*

（江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

為了提高小球藻的生物量，對BG11培養基的成分進行了響應面優化。通過單因素實驗篩選出了適合小球藻生長的最佳碳源、氮源分別為葡萄糖和尿素，并發現適量添加海綠素可顯著促進小球藻的生長。利用Minitab軟件設計Plackett-Burman實驗篩選出了影響小球藻生長的三個最重要因子；通過Box-Behnken實驗及響應面分析確定了三個因子的最佳濃度：磷酸氫二鉀58mg/L，硫酸鎂162mg/L，海綠素198μL/L。用優化后的培養基培養小球藻，48h后的藻細胞干重達10.09g/L，比優化前提高了61.2%，油脂及蛋白質產量分別達3.62和3.81g/L。

小球藻，響應面，培養基優化，海綠素

Abstract：In order to improve the biomass yield of Chlorella vulgaris，optimization of BG11 medium was carried out by response surface analysis.The optimal carbon and nitrogen sources for C.vulgaris were glucose and urea，respectively.An appropriate amount of seaweed liquid fertilizer could significantly promote the growth of C.vulgaris.Three most important substrates for C.vulgaris were screened via Plackett-Burman experiments using Minitab software.Optimal concentrations of the three substrates were confirmed by Box-Behnken design and response surface analysis.The results were 58mg/L of dipotassium hydrogen phosphate，162mg/L of magnesium sulfate and 198μL/L of seaweed liquid fertilizer.Cultivated with the optimized medium，dry cell weight of C.vulgaris after 48h reached 10.09g/L，increased by 61.2%compared with the original medium.The lipids yield was 3.62g/L，and the protein yield was 3.81g/L.

Key words：Chlorella vulgaris；response surface analysis；culture medium optimization；seaweed liquid fertilizer

小球藻含有豐富的蛋白質、維生素、礦物質元素、多不飽和脂肪酸等重要的營養物質，被FAO列為21世紀綠色健康食品[1]。1890年荷蘭微生物學家首次獲取了小球藻的純培養物；1950年，小球藻作為優質營養品在日本率先被引入市場[2]。小球藻細胞內含有多種活性成分如多糖、色素、小球藻生長因子（CGF）等[3]，由小球藻加工制成的多種食品[4]、飼料[5-6]、保健品等[7-8]已經得以研發生產，對小球藻的研究也逐漸成為國內外研究的前沿和焦點。小球藻可以進行自養生長，也可以利用一些有機碳源進行異養生長[9]。與自養相比，異養培養能大幅度提高小球藻的生長速率，為工業化生產提供可能[10]。培養基的成分是影響小球藻生長速率的主要因素，對培養基的優化是提高小球藻產量的有效途徑。響應面分析法通過合理設計實驗并對數據進行統計分析，建立二次響應面回歸模型，進而尋求最優響應因子水平及響應值[11]。海綠素（seaweed liquid fertilizer）是一種天然海藻提取物，由英國歐麥思農用流體公司研發，因含有生長素、細胞分裂素等多種天然植物激素及維生素、低聚糖等活性因子，海綠素已在農業領域得到應用[12]，但其對藻類影響的研究尚未見報道，本文考察了碳源、氮源及海綠素對小球藻生長的影響，并對培養基的成分進行了響應面優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普通小球藻（Chlorella vulgaris） 本實驗室保藏藻種，編號CV03；基礎培養基 BG11[13]；海綠素 北京新禾豐農化有限公司；葡萄糖等 國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

GXZ光照培養箱 寧波艾德電子有限公司；HYLB全溫搖瓶柜 太倉市強樂實驗設備有限公司；UV-2800AH紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；VELP UDK152全自動凱氏定氮儀 北京盈盛恒泰科技有限責任公司。

1.2 培養基的優化方法

1.2.1 單因素實驗

1.2.1.1 碳源、氮源實驗 碳源：以BG11為基礎，分別添加相同碳質量濃度（4.8g/L）的葡萄糖、果糖、蔗糖和醋酸鈉培養小球藻，對照組不添加有機碳源進行光照培養，光照強度4000lux，光暗周期比為14L/10D，接種后48h取樣測細胞干重。

氮源：分別用相同氮質量濃度（0.25g/L）的硝酸鈉、氯化銨、尿素和甘氨酸作為氮源，對照組不添加氮源，接種后48h取樣測細胞干重。

1.2.1.2 海綠素實驗 向BG11培養基中分別加入不同濃度的海綠素，接種后48h取樣測藻細胞干重，觀察海綠素對小球藻生長的影響。

1.2.2 Plackett-Burman（PB）實驗 Plackett-Burman設計法，是兩水平部分因子實驗，適合從眾多因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素，以便進一步詳細研究[14]。根據前面的單因素實驗結果設計PB實驗，實驗次數N=12，響應值為培養48h后小球藻的細胞干重。

1.2.3 最陡爬坡實驗 響應面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實情形，在其他區域里擬合方程與被近似的函數方程毫無相似之處，幾乎無意義[15]。最陡爬坡實驗以因子水平變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因子的效應來確定步長，能快速、準確地逼近最佳值區域[16]。對PB實驗所篩選出的重要因子進行最陡爬坡實驗來確定各因素的水平。

1.2.4 響應面分析 響應面分析法是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法，其中常用的是Box-Behnken的中心組合設計原理[17]。根據PB實驗及最陡爬坡實驗結果，設計Box-Behnken實驗并對其結果進行響應面分析。

1.2.5 測定方法

1.2.5.1 細胞干重的測定 通過擬合藻細胞干重與藻液吸光值之間的線性關系來測定[18]：取對數期藻液，經紫外可見分光光度計掃描300～800nm，結果顯示小球藻在680nm處有最大吸收峰值。取一定量藻液，經不同比例稀釋，測定各稀釋度對應的細胞干重和吸光值，得到線性回歸方程：

細胞干重（g/L）=0.422×OD680-0.0026，R2=0.9971

1.2.5.2 油脂含量的測定 乙醚-石油醚法[19]。

1.2.5.3 蛋白質含量的測定 凱氏定氮法[20]。

2 結果與討論

2.1 不同碳源、氮源對小球藻生長的影響

碳源、氮源實驗結果見表1。

表1 不同碳源、氮源對小球藻生長的影響Table 1 Effect of different carbon and nitrogen sources on the growth of C.vulgaris

結果表明，葡萄糖為小球藻的最佳碳源，48h后的細胞干重比對照組提高了5倍，其次是蔗糖，而以醋酸鈉和果糖為碳源組，細胞干重僅比對照組略微增加。

沒有添加氮源的對照組小球藻生長最為緩慢，以尿素作為氮源培養小球藻生長最快，其次是硝酸鈉和甘氨酸，而以氯化銨作為氮源，觀察到藻液變黃，小球藻長勢較差。

2.2 海綠素對小球藻生長的影響

國內外在海綠素對植物生長的影響方面做了大量研究，例如Thirumaran等[21]研究發現，20%的海綠素會促進秋葵（Abelmoschus esculentus）的生長；陳衛民等[22]指出，適量噴施海綠素可以改善全球紅葡萄的果實品質；據報道海綠素對棉花、玉米的生長發育也有促進作用[23-24]。藻類與植物在一些生理特性上存在相似性，因此考慮海綠素可能也會對藻類的生長繁殖起到促進作用。海綠素對小球藻生長的影響實驗結果見圖1。

圖1 海綠素對小球藻生長的影響Fig.1 Effect of seaweed liquid fertilizer on the growth of C.vulgaris

由圖1可知，當海綠素濃度低于500μL/L時，能夠促進小球藻的生長；在100μL/L時效果最佳，藻細胞干重（6.200g/L）相比對照組（4.380g/L）提高了41.55%；當海綠素的添加量分別為1000和2000μL/L時，藻細胞干重分別為3.754和2.943g/L，均比對照組低。這表明，適量的海綠素會促進小球藻的生長，而當海綠素添加量大于1000μL/L時，對小球藻的生長無促進作用，相反會抑制小球藻的生長。其原因可能是低濃度的海綠素為小球藻的生長提供了豐富的生長因子，海綠素中的細胞分裂素成分能夠促進小球藻細胞的分裂增殖，從而使小球藻的細胞密度增大；但隨著海綠素濃度的增大，培養基中高濃度的細胞分裂素會對藻細胞產生毒害作用，從而抑制了藻細胞的生長。本實驗首次發現了海綠素對藻類生長的促進效應，可為海綠素在藻類培養中的應用提供一定的理論依據。

2.3 Plackett-Burman（PB）實驗設計及結果

PB實驗選取葡萄糖等影響小球藻生物量的7個因素進行考察，每個因素分高、低兩個水平，其中高水平為低水平的1.5倍，PB實驗設計及結果見表2。

由表2可以看出，影響小球藻細胞干重的重要因子（置信度＞90%）包括海綠素、硫酸鎂和磷酸氫二鉀，且均為正效應（T值＞0），其中海綠素的主效應極顯著（p=0.004），而其他因素的影響不顯著。利用Minitab軟件繪出各因子標準化效應的Pareto圖（圖2），響應值為培養48h后小球藻的細胞干重，α=0.05，Minitab在Pareto圖中顯示效應的絕對值，由Pareto圖可以更為直觀地發現海綠素、硫酸鎂、磷酸氫二鉀具有顯著性（t＞參考值2.132）。因此將海綠素、硫酸鎂、磷酸氫二鉀3個培養基組分作為主要因子進行下一步的分析研究。

表2 PB實驗設計及結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

圖2 標準化效應的Pareto圖Fig.2 Pareto chart of standardized effect

2.4 最陡爬坡實驗設計及結果

由PB實驗結果可知，對小球藻細胞干重有顯著影響的海綠素、硫酸鎂、磷酸氫二鉀皆為正效應，因此其濃度水平應增加，根據三個因素的效應值大小設計它們的變化方向及步長進行最陡爬坡實驗，實驗設計及結果見表3。

表3 最陡爬坡實驗設計及結果Table 3 Design and results of steepest ascent test

從表3可以看出，最佳水平條件出現在實驗組2與實驗組3之間，確定以實驗組3的條件為響應面實驗的中心點。

2.5 Box-Behnken實驗結果分析

根據PB及最陡爬坡實驗結果確定Box-Behnken實驗的三個因素及其水平，具體見表4。

Box-Behnken實驗設計及結果見表5。以小球藻的細胞干重為響應值，利用Minitab軟件對Box-Behnken的實驗結果進行回歸分析及回歸擬合[25]（表6），得到響應值Y與因子X之間的回歸方程：Y=10.0283+0.0237X1+0.1635X2-0.1029X3-0.4315X12-0.2469X22-0.3576X32-0.1424X1X2+0.1583X1X3+0.1319X2X3

由表6中的回歸分析結果可知，模擬方程中的常量項p值為0，表明此模型顯著。其中X2、X12、X22、X32和X1X3對小球藻的細胞干重都有顯著的影響（p＜0.05），決定系數R2為0.9595，表明此回歸方程擬合得很好[26]。回歸方程的方差分析結果見表7，可知回歸、線性、平方及交互作用的效應都較顯著（p值分別為0.006、0.033、0.002和0.047），失擬檢測p值為0.300（＞0.05），表明失擬不顯著，回歸模型適合[27]。

表4 Box-Behnken實驗的因素與水平設計Table 4 Factors and levels of Box-Behnken design

表5 Box-Behnken實驗設計及結果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

表6 回歸方程的系數估計值Table 6 Estimation value of regression coefficient in regression equation

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.6 響應面最優值的獲取及驗證

利用Minitab軟件繪制出上述回歸方程的響應面立體圖，見圖3～圖5。

圖3 Y=f（X1、X2）響應面立體分析圖Fig.3Response surface plot of the function Y=f（X1、X2）

圖4 Y=f（X1、X3）響應面立體分析圖Fig.4Response surface plot of the function Y=f（X1、X3）

圖5 Y=f（X2、X3）響應面立體分析圖Fig.5Response surface plot of the function Y=f（X2、X3）

對回歸方程取一階偏導等于零得三元一次方程組，利用Matlab軟件求解[28]，得極值點坐標X1=-0.0424，X2=0.3181，X3=-0.0946，相應因子及對應值分別為：海綠素198μL/L、硫酸鎂162mg/L、磷酸氫二鉀58mg/L，并預測響應值（48h后小球藻的細胞干重）為10.06g/L。以優化前的培養基為對照，用此模型條件培養小球藻，48h后的藻細胞干重為10.09g/L（與預測值差0.3%），比對照組（6.26g/L）提高了61.2%；油脂含量為3.62g/L，占細胞干重的35.88%；蛋白質含量為3.81g/L，占細胞干重的37.76%。

3 結論

本文通過單因子實驗發現，小球藻的最佳碳、氮源為葡萄糖和尿素；適當濃度的海綠素對小球藻的生長具有顯著促進作用，當海綠素的濃度為100μL/L時，效果最佳，藻細胞干重相比對照提高了41.55%；而當濃度大于1000μL/L時，對小球藻的生長則產生抑制作用。

利用Minitab軟件設計實驗對BG11培養基進行了響應面優化分析，優化后的BG11培養基配方為：K2HPO458mg/L，MgSO4·7H2O 162mg/L，海綠素198μL/L；其他成分的濃度為：葡萄糖12g/L，尿素0.53g/L，CaCl2·2H2O 0.036g/L，檸檬酸0.006g/L，檸檬酸鐵銨0.006g/L，EDTANa20.001g/L，A5微量元素液1mL/L；利用此優化后的培養基培養小球藻，48h后的藻細胞干重達10.09g/L，比優化前提高了61.2%。

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Optimization of medium for Chlorella vulgaris by response surface analysis

GE Zhen-zhen，WANG Jie，ZHOU Can-can，YU Xiao-bin*
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0195-05

2012-01-04 *通訊聯系人

葛珍珍（1988-），女，碩士，研究方向：微生物學。