動(dòng)物源性食品鴨血、豬血DNA提取及多重PCR鑒別研究

呂二盼，周 正，周 巍，李洋洋，張 薇，吳 濤，曾小盼，李 波，張 偉，*

（1.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北石家莊 050091；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

動(dòng)物源性食品鴨血、豬血DNA提取及多重PCR鑒別研究

呂二盼1，2，周 正1，周 巍1，李洋洋2，張 薇1，吳 濤1，曾小盼1，李 波1，張 偉2，*

（1.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北石家莊 050091；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

目的：研究從鴨血、豬血中提取DNA的快速簡(jiǎn)便方法并建立多重PCR鑒別方法。方法：用KI提取法從固體塊狀鴨血、豬血中提取DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)提取效果。建立多重PCR方法鑒別動(dòng)物源性食品中的鴨血、豬血成分，并對(duì)市售動(dòng)物源性血制品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：這種方法提取到的DNA純度較高，凝膠電泳條帶整齊，背景清晰；PCR反應(yīng)能擴(kuò)增出目的條帶。多重PCR能同時(shí)擴(kuò)增出鴨和豬的條帶。結(jié)論：這種改進(jìn)的DNA抽提方法能獲得高純度DNA，比傳統(tǒng)方法安全、簡(jiǎn)便、節(jié)省試劑，PCR擴(kuò)增結(jié)果很好，應(yīng)用多重PCR方法能同時(shí)檢測(cè)出血樣制品中的鴨、豬成分。

鴨血、豬血DNA，核酸提取，多重PCR檢測(cè)

Abstract：Objective：Study on duck blood and pig blood aimed to find a quick and easy way to extract DNA and establish multiple PCR method for identification.Methods：The KI method was used for DNA extracting from the solid massive duck blood and pig blood and was detected by PCR amplification.A multiplex PCR method was established to identify the duck，pig blood ingredients in the food of animal original and carried on the examination to animal blood products from the market.Results：The gel electrophoresis stripes indicated that this DNA extraction method was of high purity，clear and neat.And the target bands could be amplified by PCR.Multiplex PCR simultaneously amplified duck and pig bands.Conclusion：The improved DNA extraction methods could obtain the DNA of high purity.It was safe，convenient and economical compared with the traditional method.PCR.Amplification result was good，the application of multiplex PCR method could also detect duck and pig ingredients in the blood product sample.

Key words：duck，pig blood DNA；nucleic acid extracting；multiplex PCR detect

近年來(lái)，隨著瘋牛病、羊瘙癢病、口蹄疫、禽流感等一些疾病在歐洲及世界各國(guó)的流行，以及一些動(dòng)物源食品摻假造假現(xiàn)象的普遍產(chǎn)生，對(duì)食品、藥品以及飼料產(chǎn)品進(jìn)行動(dòng)物源性成分鑒定，已經(jīng)成為一個(gè)備受關(guān)注的問(wèn)題[1-2]。尤其是現(xiàn)在時(shí)期，動(dòng)物源性食品摻假、過(guò)分添加各種添加劑、使用非食用性原料和成分等各種食品安全問(wèn)題不斷出現(xiàn)，去年雙匯瘦肉精事件、染色饅頭事件、河南南陽(yáng)毒韭菜事件等食品安全事件的頻發(fā)越來(lái)越讓老百姓心驚膽顫。近年來(lái)有不少關(guān)于動(dòng)物全基因組DNA提取的研究和報(bào)道[3-4]，但以血樣做材料的研究比較少，同時(shí)由于不同的材料和提取方法的差異，提取的基因組DNA的純度和量也有所不同，如何選取合適的組織材料利用恰當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)提取高質(zhì)量的基因組DNA，是一個(gè)值得探討的問(wèn)題[5]。鴨血因營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、食用功效好而價(jià)格明顯高于豬血價(jià)格，部分商家為了盈利可能會(huì)在鴨血中摻雜豬血甚至牛血、雞血來(lái)銷(xiāo)售。針對(duì)鴨血的加工過(guò)程及現(xiàn)實(shí)中存在的上述問(wèn)題，本研究針對(duì)如何從鴨血、豬血中提取高質(zhì)量DNA進(jìn)行分析比較，對(duì)傳統(tǒng)的方法進(jìn)行了改進(jìn)[6]，在省時(shí)、高效的同時(shí)減少對(duì)操作人員的身體危害。以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)被廣泛用來(lái)鑒定食品中的動(dòng)物源性成分[7-8]，高質(zhì)量、高純度及結(jié)構(gòu)完整的基因組DNA的獲得是開(kāi)展該方面研究工作的前提，是保證各檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)順利進(jìn)行這項(xiàng)工作的必要條件。本實(shí)驗(yàn)分別采用鴨、豬特異性引物對(duì)從血樣中提取的DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究在同一體系中加入豬和鴨的引物以及幾種動(dòng)物血樣的混合模板建立多重PCR快速鑒別方法，之后隨機(jī)抽取一定數(shù)量的市售血樣制品（主要是血豆腐食品）進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)，來(lái)驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性和可操作性，為各監(jiān)管部門(mén)和檢疫機(jī)構(gòu)提供實(shí)際指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鴨血、豬血 石家莊超市；氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇 優(yōu)級(jí)純；醋酸鈉 分析純，純度99%，配制成3mol/L；KI分析純，純度98.5%，配制成6mol/L，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；引物 生工生物工程（上海）有限公司合成；PCR體系預(yù)混液Premix Taq Version 2.0（Loading dye mix） 寶生物工程（大連）有限公司，溶液組成：Taq酶1.25U/μL；dNTP Mixture 2×conc各0.4mmol/L；Taq Buffer 2×conc 3mmol/L Mg2+，色素Marker，比重增加物，穩(wěn)定劑。

DYY-4C型電泳儀 配有DYCP-31系列DNA水平電泳槽和垂直電泳槽，北京市六一儀器廠(chǎng)；Universal Hood II凝膠成像儀 配有WHITE和UV燈，Quantity One圖像分析處理系統(tǒng)，美國(guó)BIORAD公司；Mastercycler gradient PCR儀 配有96孔反應(yīng)板和可調(diào)梯度設(shè)置，德國(guó)Eppendorf；TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī) 配有12孔可調(diào)離心轉(zhuǎn)子，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 引物

參照文獻(xiàn)[9]合成擴(kuò)增鴨源性成分的引物，參照文獻(xiàn)[10]合成擴(kuò)增豬源性成分的引物，引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Table 1 The primer sequence and amplification length

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 KI法提取DNA 取0.4g血樣于1.5mL EP管中，在液氮環(huán)境中搗碎；加雙蒸水400μL溶解，搖勻20s；混勻后加6mol/L KI溶液400μL，搖勻20s，12000r/min離心12min；取上清，加等體積氯仿/異戊醇（24∶1），即加即搖，混勻，12000r/min離心10min；取上清，加1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，室溫沉淀15min，12000r/min離心10min；小心倒掉上清，吸水紙上拍干，用-20℃保存的75%乙醇洗滌（500μL或1mL），不振動(dòng)，12000r/min離心10min；棄乙醇，干燥后，加TE溶液30μL溶解DNA[11]，制成的DNA溶液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA質(zhì)量及純度檢測(cè) 通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取鴨血、豬血基因組總DNA片斷大小及DNA的降解情況，以檢測(cè)其完整性和質(zhì)量。電泳完后凝膠成像分析。

提取的溶于TE的DNA樣品經(jīng)稀釋后，以TE做空白對(duì)照在紫外分光光度計(jì)上測(cè)260nm和280nm的光吸收，根據(jù)OD260nm/OD280nm來(lái)估計(jì)DNA的純度。根據(jù)公式計(jì)算DNA濃度或儀器計(jì)量顯示濃度。

DNA濃度（μg/μL）=OD260nm×核酸稀釋倍數(shù)×50/1000

1.3.3 引物特異性檢測(cè) 利用鴨的引物，分別以鴨、雞、牛、羊、豬的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用豬的引物，分別以鴨、雞、牛、羊、豬的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以鑒定引物的特異性。

1.3.4 建立多重PCR方法鑒別摻假成分 雙重PCR反應(yīng)體系為：預(yù)混液25μL，鴨引物各2μL，豬引物各0.5μL（引物濃度為20μmol/L），鴨模板1μg，豬模板0.5μg，用ddH2O補(bǔ)足體系50μL。雙重PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火40s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

之后將雞血、兔血與鴨血、豬血以適當(dāng)比例混合均勻后，提取幾種動(dòng)物的總DNA，然后用鴨、豬特異性引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。多重PCR反應(yīng)體系為：預(yù)混液25μL，鴨引物各2μL，豬引物各0.5μL（引物濃度為20μmol/L），混合模板2μg，用ddH2O補(bǔ)足體系50μL。多重PCR反應(yīng)條件同雙重PCR反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳確定。

1.3.5 多重PCR靈敏度檢測(cè) 將雞血、兔血、鴨血、豬血等比例混合后用1.3.1方法提取總基因組DNA，模板DNA經(jīng)10、100、200、1000、2000倍系列稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)多重PCR方法的靈敏度[12]。

1.3.6 實(shí)際樣品檢測(cè) 在建立多重PCR的快速鑒別方法后，我們將研究對(duì)象擴(kuò)展到實(shí)際樣品，以檢測(cè)用多重PCR方法能否成功擴(kuò)增出市售血制品中所含的動(dòng)物源性成分，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和可行性。我們從超市和集貿(mào)市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)13種常見(jiàn)的血豆腐制品，用多重PCR方法進(jìn)行了鴨源性成分和豬源性成分的檢測(cè)，同時(shí)用新鮮鴨血、豬血DNA做陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取的DNA質(zhì)量及純度結(jié)果

常用的電泳緩沖液有TAE和TBE，TAE緩沖能力較低，后者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。此實(shí)驗(yàn)所用緩沖體系為T(mén)BE電泳液，在室溫以5V/cm恒壓電泳，所提取的鴨血、豬血DNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，此方法所獲基因組DNA均呈現(xiàn)亮帶，電泳條帶清晰、片段的大小一致，整齊均勻，背景清晰。所提DNA所測(cè)OD260nm/OD280nm值在1.70～1.93，濃度為（0.1～2.0）μg/μL。分光光度分析DNA的OD260nm/OD280nm數(shù)據(jù)與提取過(guò)程中有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的次數(shù)有關(guān)，反復(fù)沉淀的次數(shù)多了，DNA產(chǎn)品損失就大；沉淀的次數(shù)少了，蛋白質(zhì)分離就不徹底。紫外分光光度計(jì)是采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光，光源透過(guò)測(cè)試樣品時(shí)，分子中的某些基團(tuán)吸收了紫外可見(jiàn)光，發(fā)生了電子能級(jí)躍遷而產(chǎn)生吸收光譜，反映了分子中基團(tuán)的信息。吸收紫外光的性質(zhì)是嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質(zhì)，都有吸收紫外光的特性。堿基展開(kāi)程度越大，紫外吸收就越厲害。通過(guò)紫外測(cè)得溶液的吸光度，計(jì)算樣品的吸光度值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度，二者成正比。核酸的λm＝260nm，即在波長(zhǎng)260nm處有最高吸收峰。DNA是脫氧核糖核苷酸的高聚物，雙螺旋結(jié)構(gòu)。RNA是核糖核苷酸聚合而形成的沒(méi)有分支的單鏈，分子量比DNA小；DNA為線(xiàn)狀分子，RNA為線(xiàn)團(tuán)。但紫外分光光度法不能區(qū)分DNA和RNA，OD260nm/OD280nm只能用來(lái)鑒定核酸的純度。純DNA的OD260nm/OD280nm比值為1.8，純RNA為2.0。由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的芳香氨基酸（酪氨酸和色氨酸），因此也能吸收紫外光。其吸收高峰在280nm波長(zhǎng)處，可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)，在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估。當(dāng)OD260nm/OD280nm大于等于2.0，說(shuō)明殘存的RNA較多；當(dāng)OD260nm/OD280nm小于1.8，說(shuō)明提的DNA不純，存在蛋白質(zhì)（芳香族）或酚等雜質(zhì)；當(dāng)OD260nm/OD280nm等于1.8時(shí)，說(shuō)明樣品中蛋白質(zhì)含量低，DNA純度高。由測(cè)得結(jié)果可知，提取的DNA無(wú)RNA和蛋白質(zhì)或酚的污染，且沒(méi)有在提取過(guò)程中發(fā)生降解。從血樣中提取的總DNA無(wú)論是濃度還是純度都較高，完整性很好，達(dá)到了PCR反應(yīng)的要求，能滿(mǎn)足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需要。

圖1 DNA提取結(jié)果Fig.1 The DNA extraction results of blood

2.2 引物特異性結(jié)果

利用鴨的引物，分別以鴨、雞、牛、羊、豬的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用豬的引物，分別以鴨、雞、牛、羊、豬的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異性結(jié)果見(jiàn)圖2～圖3。圖2只有鴨血DNA的模板能擴(kuò)增出226bp目的條帶；圖3只有豬血DNA的模板能擴(kuò)增出149bp目的條帶，其他模板都是陰性。

圖2 鴨引物的特異性結(jié)果Fig.2 The specificity result of duck primer

圖3 豬引物的特異性結(jié)果Fig.3 The specificity result of pig primer

2.3 鴨血摻假多重PCR結(jié)果

經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)對(duì)比優(yōu)化引物和模板濃度，得出上述1.3.4的加入量擴(kuò)增效果最好，原因是引物之間存在競(jìng)爭(zhēng)，豬引物的特異性較鴨引物更強(qiáng)。在一個(gè)體系中同時(shí)加入鴨和豬的引物，加入兩種血樣提取的混合模板，可同時(shí)擴(kuò)增出鴨源性成分和豬源性成分，兩個(gè)目的條帶清晰，位置與陽(yáng)性對(duì)照條帶也一致，由此我們成功建立了鴨血中摻雜豬成分的鑒別方法，此方法快速、簡(jiǎn)便，一次反應(yīng)即可同時(shí)鑒別兩種動(dòng)物源性成分，可為各檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)提供方法指導(dǎo)。雙重PCR結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 雙重PCR結(jié)果Fig.4 Double PCR results

將雞血、兔血分別與鴨血、豬血等比例混合均勻后，用提取的總DNA進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照。由圖5結(jié)果可見(jiàn)，只能擴(kuò)增出鴨和豬的特異性條帶，沒(méi)有雞和兔的非目的條帶，由此可以檢測(cè)未知的血樣中是否含有鴨和豬的成分。

圖5 多重PCR結(jié)果Fig.5 Multiple PCR results

2.4 多重PCR靈敏度結(jié)果

用KI法提取雞血、兔血、鴨血、豬血混合樣品的DNA，在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)加入鴨和豬的引物，加入四種動(dòng)物血不同稀釋度的混合模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳顯示，隨著模板濃度的降低，兩個(gè)目的條帶的亮度逐漸減弱，如圖6所示，當(dāng)稀釋1000倍時(shí)，條帶仍很明顯；當(dāng)稀釋2000倍時(shí)，豬的條帶很暗，但仍可看出，鴨的成分未擴(kuò)增出來(lái)，即稀釋至原DNA提取液的0.05%時(shí)，才不能檢測(cè)出鴨成分，此方法的檢測(cè)靈敏度為0.1%。多重PCR對(duì)豬血的靈敏度較鴨血更高，與實(shí)驗(yàn)中單一PCR靈敏度結(jié)果相符合，可能是引物的原因。

圖6 多重PCR靈敏度結(jié)果Fig.6 Sensitivity results of multiple PCR

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)抽取的13個(gè)樣品中，10個(gè)都檢測(cè)出鴨源性成分，但有的也摻雜有豬血，3個(gè)樣品鴨成分為陰性，有的是豬血做的假冒產(chǎn)品，有的可能是豬血外的其他動(dòng)物血制成。3個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)出鴨和豬兩種成分。結(jié)果見(jiàn)表2。證明此方法能檢測(cè)血豆腐制品中的鴨源性成分和豬源性成分能進(jìn)行假冒偽劣產(chǎn)品的鑒別，可進(jìn)行推廣應(yīng)用。

表2 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of Actual samples

3 結(jié)論

基因組DNA的提取過(guò)程，研究中對(duì)經(jīng)典酚-氯仿抽提法進(jìn)行了改進(jìn)。對(duì)于樣品的預(yù)處理，采用液氮進(jìn)行冷凍研磨，防止了因研磨過(guò)程中發(fā)熱而導(dǎo)致的DNA降解和斷裂，從而保證了DNA的完整性，且節(jié)省時(shí)間。KI在高溫不穩(wěn)定，而在此實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有水浴加熱過(guò)程，都是在室溫操作（條件允許可用可調(diào)溫度離心機(jī)4℃離心），且使用的是雙蒸水，不用擔(dān)心水中含有Cl-等而導(dǎo)致的碘被氧化問(wèn)題。DNA沉淀加NaAc等鹽可中和核酸負(fù)電荷，在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸疏水復(fù)性，加無(wú)水乙醇可以使DNA沉淀完全，添加的量必須注意，NaAc控制在所吸取上清的1/12～1/10，無(wú)水乙醇要加2～3倍體積。本法不用水浴，所用試劑少，離心次數(shù)少，簡(jiǎn)便、快速，不需特殊設(shè)備；所獲得的DNA無(wú)RNA、蛋白質(zhì)等污染；減少了各種有害因素對(duì)DNA的破壞，具有完整性好、純度高和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)；可以滿(mǎn)足PCR、RFLP酶切、分子雜交等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需要。綜上所述，是切實(shí)可行的方法，對(duì)大量固體塊狀血樣制品的提取更為實(shí)用。

鑒別食品中的動(dòng)物源性成分及各種食品的摻雜摻假，一直是各檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)工作的重點(diǎn)，用分子生物學(xué)的檢測(cè)方法比其他方法更準(zhǔn)確、快速。本研究用PCR方法檢測(cè)血豆腐類(lèi)制品準(zhǔn)確率高，耗時(shí)短，從DNA提取到擴(kuò)增所需檢測(cè)的動(dòng)物成分，再電泳出結(jié)果，整個(gè)操作過(guò)程最多僅需3h，而且可一次同時(shí)對(duì)幾十個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。建立的多重PCR方法更能顯示此方法的優(yōu)點(diǎn)，可一次反應(yīng)同時(shí)鑒別兩種成分，在鑒定真?zhèn)蔚耐瑫r(shí)還能具體測(cè)出鴨血豆腐是否摻雜有豬血成分。有的偽劣鴨血制品是用豬血以外的其他動(dòng)物血制成，可能是雞血或牛血、兔血等，下一步我們會(huì)繼續(xù)研究建立鴨、豬、雞、牛、兔等的多重PCR鑒別方法來(lái)徹底解決這一難題，能準(zhǔn)確鑒別鴨血制品中的其他多種動(dòng)物源性成分，可為質(zhì)檢部門(mén)推廣應(yīng)用，作為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)手段。

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DNA extraction and multiple PCR distinction research of animal food duck blood and pig blood

LV Er-pan1，2，ZHOU Zheng1，ZHOU Wei1，LI Yang-yang2，ZHANG Wei1，WU Tao1，ZENG Xiao-pan1，LI Bo1，ZHANG Wei2，*
（1.Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research of Hebei，Shijiazhuang 050091，China；2.College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China）

Q789

A

1002-0306（2012）16-0228-05

2012－02－07 *通訊聯(lián)系人

呂二盼（1986-），女，碩士，研究方向：食品中有害微生物檢測(cè)與控制。

河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局重點(diǎn)項(xiàng)目（100102）。