蜂巢醋液態發酵工藝及其抗氧化活性研究

王振斌，孫 平，王 林，姜美花，夏 蓉

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013；2.江蘇恒順醋業股份有限公司，江蘇鎮江 212013）

蜂巢醋液態發酵工藝及其抗氧化活性研究

王振斌1，孫 平1，王 林1，姜美花1，夏 蓉2

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013；2.江蘇恒順醋業股份有限公司，江蘇鎮江 212013）

研究首次將蜂巢引入食醋的液態發酵工藝，優化獲得了蜂巢醋液態發酵的最佳工藝條件：起始糖度5.33%，酵母活化液0.10%，酒精度5.0%，醋酸發酵溫度35℃。在此條件下制備的蜂巢醋由于發酵原料和菌種單一，在可溶性固形物、總糖、香氣、滋味等方面低于傳統固態發酵產品，而在色澤、體態和風味典型性等方面較優。此外，該蜂巢醋DPPH自由基清除能力（33.29%）和總抗氧化能力（2252.63mmol·g-1）均顯著低于固態發酵（66.25%，5092.63mmol·g-1）產品，這主要歸因于和固態發酵峰巢醋總黃酮和總多酚（0.71%，2.33%）相比，液態發酵蜂巢醋總黃酮和總多酚含量（0.38%，1.20%）較低。

蜂巢醋，發酵工藝，抗氧化

Abstract：Honeycomb was used as raw material in the liquid fermentation of vinegar for the first time in this paper.The fermentation process was optimized and the optimum conditions was obtained：5.33%of initial sugar degree，0.10%of yeast activated liquid，5.0%of alcohol degree，35℃ of acetate fermentation temperature.Under the conditions，compared to solid-state fermentation the honeycomb vinegar was lower in soluble solids，total sugar，aroma，taste，but was higher in color，posture，flavor typicality.These results could be attributed to the single materials and strain in liquid fermentation of honeycomb vinegar.Moreover，DPPH radical scavenging activity（33.29%） and total antioxidant capacity（2252.63mmol·g-1） of the honeycomb vinegar by liquid fermentation were significantly lower than that of solid-state fermentation（66.25%，5092.63mmol·g-1），due to the lower content of flavonoids and polyphenol（0.38%，1.20%） compared to solid-state fermentation（0.71%，2.33%）.

Key words：honeycomb vinegar；fermentation technology；antioxidant activity

蜂巢（Honeycomb）是由蜜蜂的分泌物和采集物筑成的巢房，是蜂群生活、繁衍后代和貯存食物的場所，含有蜂蜜、蜂蠟、蜂花粉、蜂王漿、蜂膠、蜂毒、繭衣、幼蟲分泌物等多種物質，營養豐富[1-2]。現代醫學研究表明蜂巢具有抑菌、抗病毒、降血脂、抑制腫瘤、提高免疫等多種功效[3-7]。然而，目前蜂巢主要用于制備蜂蠟、蜂巢復合飲料和蜂巢素，研究利用較為落后。食醋是我國傳統的酸性調味品，不僅含有豐富的營養成分，而且具有獨特的藥理作用，其生產主要基于固態或液態發酵。傳統固態發酵生產周期長，勞動強度大；液態發酵周期短，產能大，勞動強度低，原料利用率高，是現代食醋生產的發展趨勢[8-12]。本研究擬將蜂巢的營養功能成分引入食醋發酵過程中，優化液態深層發酵關鍵工藝參數，獲得蜂巢醋生產的最佳生產條件，為蜂巢醋的研究開發和現代化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

蜂巢 由陜西咸陽選民養蜂場提供；酵母 安琪酵母有限公司；蔗糖 市售，純度98%；醋酸菌 江蘇恒順醋業股份有限公司；VC、DPPH（二苯代苦味酞肪自由基）、TPTZ（三吡啶三吖嗪） Sigma公司。

HH.B11-600-S型恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；TU-1810型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；DELTA320型pH計 上海梅特勒—托利多儀器有限公司；DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌器 上海三申醫療器械有限公司；WYT型手持糖度儀 成都光學廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂巢醋發酵工藝優化

1.2.1.1 固態發酵 在鎮江香醋傳統固態發酵的基礎上，以蜂巢提取液替代糯米浸漬用水，流程如下：蜂巢原料→解凍粉碎→20目過篩→超聲波水浴提取（超聲功率900W、超聲時間15min、液料比（L/S）=100∶1）→離心→蜂巢水提液+糯米（L/S=2∶1）→浸漬、蒸煮、淋飯冷卻→拌曲糖化、酒精發酵→加入醋酸菌發酵→淋醋殺菌→灌裝保存[13-14]

1.2.1.2 液態發酵 液態深層發酵工藝流程如下：蜂巢水提液（1.2.1.1）+蔗糖→滅菌（60℃，30min）→加入酵母，酒精發酵→調酒精度、pH→加入醋酸菌發酵→淋醋殺菌→灌裝保存[15-16]

1.2.2 蜂巢醋抗氧化活性評價

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的測定 取0.5mL樣品于試管中，加入1.0mL 0.1mmol·L-1DPPH溶液振蕩搖勻，空白對照為95%乙醇，常溫避光反應60min后于517nm測定吸光度，采用以下公式計算抑制率：

式中：Y：DPPH自由基抑制率（%），A0：空白對照吸光度，A：樣品吸光度[17-18]。

1.2.2.2 總抗氧化能力的測定 采用FRAP法測定總抗氧化能力，取100μL樣品于試管中，加入1.0mL FRAP工作液（0.3mol·L-1，pH3.6乙酸鈉緩沖液、10mmol·L-1TPTZ溶液和20mol·L-1三氯化鐵，以體積比10∶1∶1混和）混合均勻，37℃反應50min，于593nm測定吸光度[19-20]。

1.2.3 蜂巢醋感官評價 蜂巢醋感官評定評分標準如表1所示。

1.2.4 成分分析 總酸、還原糖、酒精度、可溶性固形物分別根據國標GB/T10345、GB/T15038、GB/T15038、GB2719測定；總黃酮和總多酚含量分別以蘆丁、沒食子酸為標樣，采用分光光度法進行測定[21-22]。

1.2.5 統計分析 數據以三次獨立樣品測定的平均值±標準差表示；統計分析采用F檢驗，多重比較采用LSD法；p＜0.05被認定為存在顯著性差異。

表1 蜂巢醋感官評定評分標準Table 1 Full score standards of sensory evaluation of honeycomb vinegar

2 結果與分析

2.1 蜂巢醋液態發酵工藝優化

2.1.1 起始糖度對蜂巢醋酒精發酵的影響 起始糖度對蜂巢醋的后續發酵具有重要的影響，一方面因為醋酸發酵需要較高的酒精度基礎上才能穩定進行，因而必須有較高的起始糖度；另一方面，起始糖度也不可太高，否則會使得發酵醪中酒精度太高，會抑制醋酸發酵，同時由于揮發的原因而引起損失增加。蜂巢水提液的起始糖度為2.33%。在添加0.1%酵母液，發酵溫度20℃的條件下，起始糖度對蜂巢醋酒精發酵的影響如圖1所示。從圖1可知，蜂巢水提液直接酒精發酵，發酵醪酒精度最高僅為2.5%，低于進入醋酸發酵的最小酒精度（3.5%），不利于后期的醋酸發酵。當起始糖度高于5.33%時，由于酵母對酒精的耐受性和氮源等營養物質限制，發酵醪的最終酒精度無顯著差異。本實驗選取以5.33%為制備蜂巢醋酒精發酵的初始糖度。

圖1 起始糖度對蜂巢醋酒精發酵的影響Fig.1 Effect of initial sugar degree on alcohol fermentation of honeycomb vinegar

2.1.2 酵母添加量對液態發酵蜂巢醋酒精發酵的影響 在起始糖度為5.33%糖度，發酵溫度為20℃的條件下，酵母添加量對液態發酵蜂巢醋酒精發酵的影響如圖2所示。可以看出，酵母添加量為0.06%時，起酵時間長達3d，且最終的發酵醪酒精度較低（4.3%），這可能由于酵母添加量過低，酵母在發酵醪中先有氧繁殖后再無氧發酵，酵母繁殖消耗了發酵醪中的營養物質，使得酒精生成量降低。當酵母添加量高于0.10%時，起酵時間短，接種第1d酒精生成量就達到1.0%左右，第3d酒精發酵即結束，但最終酒精度卻低于0.10%的酵母添加量。因此0.10%為最適宜的酵母添加量。

圖2 酵母添加量對蜂巢醋酒精發酵的影響Fig.2 Effect of yeast activated liquid volume on alcohol fermentation of honeycomb vinegar

2.1.3 初始酒精度對蜂巢醋醋酸發酵的影響 在醋酸發酵溫度為20℃的條件下，初始酒精度對液態發酵蜂巢醋醋酸發酵的影響如圖3所示。初始酒精度對醋酸發酵有顯著的影響，當初始酒精度低于5.0%時，起酵速度快，發酵時間短，但最終醋酸生成量較低；當起始酒精度高于5.0%時，起酵速度慢，發酵時間長，最終醋酸生成量與5.0%酒精度無顯著差異。因此選取5.0%為醋酸發酵的起始酒精度。

圖3 酒精度對蜂巢醋醋酸發酵的影響Fig.3 Effect of alcohol degree on acetate fermentation of honeycomb vinegar

2.1.4 發酵溫度對蜂巢醋醋酸發酵的影響 在起始酒精度5.0%的條件下，醋酸發酵溫度對醋酸發酵的影響如圖4所示。當發酵溫度為45℃時，醋酸起酵速度最快，但最終醋酸濃度最低，其原因可能是在較高溫度下，醋酸發酵速度快，醋酸揮發速度也快，同時糖與蛋白質發生褐變反應的速度增加，部分糖不再轉化為酒精和醋酸，最終的發酵醪顏色較深，醋酸濃度較低[23]；當發酵溫度為25、30℃時，發酵速度較慢，發酵時間長達10d，最終醋酸度較高，但是發酵醪顏色較淺，香氣較淡。因此，選取35℃為醋酸發酵的適宜溫度。

綜上所述，液態發酵制備蜂巢醋的最佳工藝條件為：起始糖度5.33%，酵母活化液0.1%，酒精度5.0%，醋酸發酵溫度35℃。

圖4 溫度對蜂巢醋醋酸發酵的影響Fig.4 Effect of temperature on acetate fermentation of honeycomb vinegar

2.2 蜂巢醋成分分析與感官評價

在此條件下發酵蜂巢醋理化成分和感官評定結果如表2所示。可以看出，液態發酵蜂巢醋在可溶性固形物、總糖、香氣、滋味等方面低于固態發酵，而在色澤、體態和典型性方面明鮮優于固態發酵，其原因在于固態發酵采用糯米為原料，營養成分豐富，因而產品固形物和總糖含量高；固態發酵法時間長，菌群豐富多變，產品香氣和滋味亦較好；液態發酵以蜂巢水提液和蔗糖為主要原料，成分簡單，因而其風味典型性強。

2.3 蜂巢醋抗氧化活性評價

2.3.1 DPPH自由基清除率與總抗氧化能力 DPPH是一種穩定存在的自由基，其乙醇溶液顯紫色，在517nm處有最大吸收，當有供氫能力的抗氧化劑（如多酚）加入到其中時，和DPPH的單電子產生配對，使其在517nm處的吸收消失，吸光值越小說明抗氧化劑清除DPPH自由基能力越強[17-18]。本研究以VC為陽性對照，采用DPPH自由基清除能力分別評價了鎮江香醋、蜂巢水提液、液態發酵蜂巢醋、固態發酵蜂巢醋的抗氧化活性，結果如圖5所示。

圖5 蜂巢醋DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging activity of honeycomb vinegar

FRAP法是評價總抗氧化能力的常用方法，其原理是在酸性條件下抗氧化物可以還原Ferrictripyridyltriazine（Fe3+-TPTZ）產生藍色的Fe2+-TPTZ，在593nm測定Fe2+-TPTZ的吸光值即可獲得樣品的總抗氧化能力，并且可以抑制內源性的一些干擾因素[19-20]，結果如圖6所示。

表2 蜂巢醋成分分析與感官評價Table 2 Component analysis and sensory evaluation of honeycomb vinegar

圖6 蜂巢醋總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of honeycomb vinegar

從圖5和圖6可以看出，該液態發酵蜂巢醋DPPH自由基清除能力（33.29%）和總抗氧化能力（2252.63mmol·g-1）均顯著低于固態發酵（66.25%，5092.63mmol·g-1）產品。各樣品抗氧化能力由高到低依次為：固態發酵蜂巢醋＞VC＞鎮江香醋＞蜂巢水提液＞液態發酵蜂巢醋。

2.4 蜂巢醋抗氧化成分分析

目前黃酮和多酚被認為是天然產物中主要抗氧化物質基礎。為了進一步了解蜂巢醋的抗氧化活性物質基礎，測定了其中的總黃酮和總多酚含量，結果如表2所示。液態發酵蜂巢醋黃酮和多酚含量（0.38%，1.20%）與鎮江香醋無顯著差異，表明蜂巢水提液和糯米對最終產品主要抗氧化物質的影響相同。另一方面，液態發酵蜂巢醋黃酮和多酚含量顯著低于蜂巢水提液（0.54%，1.35%），固態發酵蜂巢醋黃酮和多酚含量（0.71%，2.33%）也明顯低于鎮江香醋和蜂巢水提液含量總和（0.99%，2.48%），這均說明在蜂巢醋發酵過程中，發酵醪中的黃酮和多酚被微生物部分消耗或轉化。再者，液態發酵蜂巢醋黃酮和多酚含量僅為固態發酵蜂巢醋的一半左右，而前者抗氧化活性也僅約為后者的一半，說明蜂巢醋的抗氧化活性與其黃酮和多酚含量具有明顯的相關性，黃酮和多酚是蜂巢醋的主要抗氧化物質基礎。

表3 蜂巢醋中總黃酮和總多酚含量Table 3 Content of total flavonoids and total polyphenol in honeycomb vinegar

3 結論

3.1 優化獲得了蜂巢醋液態發酵的最佳工藝條件：起始糖度5.33%，酵母活化液0.10%，酒精度5.0%，醋酸發酵溫度35℃。在此條件下制備的蜂巢醋由于發酵原料和菌種單一，在可溶性固形物、總糖、香氣、滋味等方面低于傳統固態發酵產品，而在色澤、體態和風味典型性等方面較優。

3.2 蜂巢醋DPPH自由基清除能力（33.29%）和總抗氧化能力（2252.63mmol·g-1）均顯著低于固態發酵（66.25%，5092.63mmol·g-1）產品，這主要歸因于和固態發酵峰巢酸總黃酮和總多酚含量（0.71%，2.33%）相比，液態發酵蜂巢醋總黃酮和總多酚含量（0.38%，1.20%）較低。

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Liquid fermentation technology and antioxidant activity of honeycomb vinegar

WANG Zhen-bin1，SUN Ping1，WANG Lin1，JIANG Mei-hua1，XIA Rong2
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.Jiangsu Hengshun Vinegar Industry Co.，Ltd.，Zhenjiang 212013，China）

TS201.2

B

1002-0306（2012）16-0236-04

2012－01－04

王振斌（1975-），男，博士，副教授，主要從事食品生物技術方面的研究。

國家星火計劃（2011GA690057）；鎮江市科技支撐項目（NY201010）。