牛不同部位肌肉高鐵肌紅蛋白還原酶活力及耗氧率對肉色穩定性的影響

謝 麗，高曉光，苗 敬，胡文娟，戴瑞彤

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

牛不同部位肌肉高鐵肌紅蛋白還原酶活力及耗氧率對肉色穩定性的影響

謝 麗，高曉光，苗 敬，胡文娟，戴瑞彤*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

為了研究牛不同部位肌肉的高鐵肌紅蛋白還原酶活力（MRA）和肉的呼吸耗氧強弱對肉色澤穩定性的影響，本文以牛的三個部位的肌肉：背最長?。↙L）、半腱肌（ST）、腰大?。≒M）為研究對象，4℃避光貯藏5d，測定MRA、肌紅蛋白（MMb）含量、耗氧率（OCR）等，探究肉色穩定性與牛肉部位、MRA和呼吸耗氧率之間的關系。結果表明，三種肌肉中，背最長肌的色澤穩定性最好，腰大肌最差，半腱肌介于中間；MRA越高的肌肉，肉色越穩定；OCR越低的肌肉，肉色越穩定。

高鐵肌紅蛋白還原酶活力（MRA），耗氧率（OCR），肉色穩定性

Abstract：In order to explore the relationships among MRA，OCR and color stability of different bovine muscles，MRA，MMb and OCR were determined in longissimus lumborum（LL），semitendinosus（ST） and psoas major（PM） displayed for 5 days at 4℃ in the dark.The result indicated that color stability of LL was best，PM worst and ST in the middle.Moreover，muscles of higher levels of MRA or lower OCR had higher color stability.

Key words：metmyoglobin reducing activity（MRA）；oxygen consumption rate（OCR）；color stability of meat

肉以及肉制品的色澤對于消費者和生產廠商都具有重要的意義，因為肉的顏色被認為是評價肉及肉制品新鮮程度和品質特征的重要指標。肉制品生產商每年因為肉色褐變的損失高達數百萬美元[1]。在屠宰后放血充分的生肉中，肉的顏色主要是由肌紅蛋白在肉中的含量和存在狀態決定的。肌紅蛋白中血紅素輔基的鐵離子為正二價時，在無氧條件下肌紅蛋白為還原型肌紅蛋白（DeoMb），肉呈現暗紫色；而氧氣充足時肌紅蛋白和氧氣結合成氧合肌紅蛋白（OxyMb）時，肉呈現出令消費者喜愛的櫻桃紅色；當肌紅蛋白血紅素輔基中的鐵離子被氧化成正三價態時，肌紅蛋白以氧化態存在的高鐵肌紅蛋白（MetMb），其在肉中的堆積會使肉呈現褐色，影響消費者的購買欲。影響牛肉色澤的內部因素和外部因素很多，比如牛的品種、宰后時間、儲藏溫度等，有學者研究了牛不同部位肌肉的成熟期間的新鮮度[2]，亦有研究表明，肌肽和脂肪氧化對肉色的穩定性有影響[3]。另據報道[4-6]，肌肉的線粒體呼吸耗氧率也是影響肌肉色澤穩定性的重要因素。此外，肉中天然存在高鐵肌紅蛋白還原系統（metmyoglobin reducing system），系統中的高鐵肌紅蛋白還原酶（metmyoglobin reductase，MRase）可以將MetMb還原，在肉宰后一段時間內保持肉顏色的穩定性[7]。研究表明[8]，牛的背最長肌是顏色最穩定的肌肉，腰大肌是顏色最不穩定的肌肉，而半腱肌的顏色穩定性介于二者之間。本文主要就魯西黃牛的三個部位肌肉：背最長肌、腰大肌和半腱肌，進行實驗研究，探究色澤穩定性、高鐵肌紅蛋白還原系統、呼吸耗氧率之間的相互關系，以期為進一步的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

牛背最長肌、腰大肌、半腱肌 均購自北京御香苑集團公司，牛的品種為魯西黃牛，宰后于4℃經24h冷卻，低溫運到實驗室，除去表面脂肪和可見的筋膜，作為后續實驗的材料；馬心肌紅蛋白、琥珀酸、NADH 美國Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA） 拜爾迪生物有限公司；蔗糖、Tris-Base、HCl、NaH2PO4、EDTA等其他實驗試劑 均為分析純，購自北京藍弋試劑公司。

AR2140型（精密度0.0001）電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；F6-10型超速勻漿器上海Fluko流體機械制造有限公司提供；WSC-S型色差計 上海精密科學儀器有限公司提供；GL-20-II型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；UV-2102C型紫外可見分光光度計 上海優尼科儀器公司；pH211臺式酸度計 意大利哈納科儀器公司；OXYGRAPH液相氧電極 英國漢莎（Hansatech）公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肉樣的處理 肉樣取自9頭育齡相同的魯西黃牛，分別將背最長肌、腰大肌、半腱肌的可見脂肪和結締組織除去，最后切分成大小相似的塊狀：2.5cm厚度、10cm左右直徑，相同肌肉的樣品置于同一托盤，測樣時均勻取樣。樣品用保鮮膜托盤包裝，儲存在（4±0.5）℃避光的冰箱中，每隔1d進行樣品的測定。

1.2.2 色差值的測定 每24h取樣，將約5g肉絞碎攪勻，填充于比色皿內，壓實抹平，保證測定時表面無氣泡和可見的細小脂肪顆粒。用色差儀測定紅度值a*、亮度值L*、黃度值b*。色差儀在使用前進行校準，白板的參數為：L*=94.61，a*=-0.52，b*=1.88。Chroma的計算式為：（a*2+b*2）1/2，Hue角度的計算式為：ATAN（b*/a*）×180/π。

1.2.3 pH的測定 取肉樣10g絞碎置于90mL去離子水中，混勻振蕩30min，測pH，重復三次取平均值。

1.2.4 高鐵肌紅蛋白還原酶活力的測定

1.2.4.1 MetMb及樣品中粗酶液的提取 按照Mikkelsen的方法[9]，進行高鐵肌紅蛋白還原酶活力的測定。肉樣10g加20mL 4℃的磷酸鹽緩沖液（2.0mmol/L，pH7.0），4℃下均質處理1min，10000r/min離心20min，上清液經中速定性濾紙過濾除去脂肪，濾液加入稍過量的高鐵氰化鉀氧化后，用冰的磷酸鹽緩沖液（2.0mmol/L，pH7.0）4℃下透析24h，期間換液三次。透析完畢后，12000r/min離心20min（4℃），上清液作為高鐵肌紅蛋白還原酶的粗提液。

1.2.4.2 還原活性的測定 還原酶的活性用分光光度法測定。配制標準反應混合物，成分如表1（pH6.4，反應溫度為25℃）所示，空白對照以水代替NADH，其他組分不變。反應加入NADH起始，用紫外-可見分光光度計在波長為580nm下，記錄吸光值。依照Mikkelsen的方法[9]，MetMb還原酶的活性用每毫升提取液在1min內在580nm下的吸光值變化來表示。在此波長下MbO2與MetMb的吸光值相差最大，兩者的摩爾消光系數為12×103L·mol-1·cm-1。通過比較反應前后（在反應線性階段）吸光值的變化，便可計算出高鐵肌紅蛋白還原活力。一個酶活力單位定義為：1U=1nmol MMb reduced/min，MMb還原酶比活力表示為反應線性階段每毫克蛋白所具有的活力單位（U/mg），每個樣品的酶活力測定重復三次，取平均值。

表1 高鐵肌紅蛋白還原酶（MRA）活力測定標準反應混合物Table 1 Reaction substances of metmyglobin reductase activity（MRA）

1.2.5 MetMb相對百分含量的測定 按照Tang[10]的方法，用分光光度計法進行MetMb相對百分含量的測定。取肉樣20g，加入100mL濃度為0.04mol/L pH6.8的磷酸鈉緩沖劑，室溫下以轉速10800r/min均質25s。均質液置于冰浴中放置1h，然后于4500×g、4℃下離心30min，將上清通過濾紙過濾，用同樣的緩沖液補足至25mL。反應體系在分光光度計上掃描，波長分別為582、557、525、503nm。利用Tang[10]的公式計算出DeoMb，OxyMb，MetMb的相對百分含量。測定公式如下：

[DeoMb]=CDeoMb/CMb=-0.543R1+1.594R2+0.552R3-1.329

[OxyMb]=COxyMb/CMb=0.722R1-1.432R2-1.659R3+2.599

[MetMb]=CMetMb/CMb=-0.159R1-0.085R2+1.262R3-0.520

式中：R1=A582/A525，R2=A557/A525，R3=A503/A525。

1.2.6 耗氧率OCR（Oxygen Consumption Rate）的測定 依據Kaplan的方法[11]，進行耗氧率的測定。OXYGRAPH液相氧電極，分別在4、25℃進行校正，用高濃度、現用現配的連二亞硫酸鈉校正零氧線，然后用去離子水清洗反應室12次以上。再用OC Buffer（70mmol/L蔗糖、0.002mmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl、5mmol/L K2HPO4，pH7.4）沖洗幾次，向反應室加入1mL OC Buffer，蓋好反應室蓋子（保持密閉，以免外界氧氣進入反應室）。開啟轉子，開始記錄氧含量，等待2min使氧含量平穩。取肉樣5g絞碎混勻在50mL去離子水中，測試時加入1mL肉液于反應室，立即計時，記錄5min內的呼吸速率，即為肉的OCR。

2 結果與討論

2.1 三種肌肉的色差值隨貯藏時間的變化

三種肌肉：背最長?。╨ongissimus lumborum，LL）、腰大肌（psoas major，PM）、半腱?。╯emitendinosus，ST）的色差值隨時間的變化見表2。隨著貯藏時間的變化，三種肌肉的色差值的變化規律有很大的不同。背最長肌的L*值隨貯藏時間先降低后升高，腰大肌的L*值升高比較緩慢，半腱肌的L*值升高最多。在第5d時背最長肌和半腱肌的L*值并沒有顯著的差異（p＞0.05）。而三種肌肉的紅度值a*都隨著貯藏時間的延長降低（p＜0.05），背最長肌5d紅度值降低了4.94，半腱肌降低了2.17，腰大肌降低了4.31；總體上紅度值是：背最長?。景腚旒。狙蠹　ＨN肌肉的Chroma都是隨貯藏時間延長逐漸減小的。這些結論與之前許多學者的實驗結果一致[12-14]，本次實驗結果亦表明，背最長肌和半腱肌的色澤穩定性優于腰大肌。

2.2 三種肌肉的pH隨貯藏時間的變化

三種肌肉的pH都隨著貯藏時間的延長而降低（p＜0.05），其中背最長肌的pH下降最多，5d下降了0.5，半腱肌和腰大肌的pH下降較為緩慢，半腱肌5d下降了0.08，腰大肌5d下降了0.17，見表3。

表2 4℃貯藏5d的三種肌肉背最長?。↙L）、半腱肌（ST）、腰大?。≒M）的色差值Table 2Instrumental color of longissimus lumborum（LL），semitendinosus（ST），psoas major（PM）at 1，2，3，4，5d（4℃）

表3 4℃貯藏1、3、5d的背最長肌（LL）、半腱?。⊿T）、腰大?。≒M）的pH變化Table 3 pH of longissimus lumborum（LL），semitendinosus（ST），psoas major（PM）at 1，3，5d（4℃）

第5d腰大肌的pH在三種肌肉中保持最高，這與Mark Seyfert的實驗結果一致[12]，LL、ST、PM最終pH在5.5～5.7之間，且PM最高。本實驗的結果支持了D R Mckenna的pH與色澤的相關性并不顯著的結論[14]，他認為pH的差異并不顯著，實驗中僅相差0.1左右的差異在實際生產中是可以忽略的，pH與色澤的關聯程度不高。在pH對肉色穩定性的影響方面，仍存在爭議。

2.3 三種肌肉高鐵肌紅蛋白還原酶活力（MRA）隨貯藏時間的變化

三種肌肉高鐵肌紅蛋白還原酶活力（MRA）隨貯藏時間的變化見圖1，三種肌肉的MRA都隨著貯藏時間的延長而降低，背最長肌5d后MRA降低了0.026，半腱肌5d后MRA降低了0.025，腰大肌5d后MRA降低了0.024，三種肌肉MRA降低量基本一致，趨勢與紅度值a*隨貯藏時間的變化相一致。許多學者的研究表明[12-14]，紅度值a*和Chroma與MRA的相關性很大，而且都是LL＞ST＞PM，色澤更穩定的肌肉（如背最長肌和半腱?。┑腗RA要比色澤穩定性差的肌肉（如腰大?。└摺 R Mckenn的研究[14]表明，色澤穩定性更高的肌肉，RIMF（Resistance to induced meymyglobin）值更高，即色澤越穩定的肌肉，積累的MetMb的量越少，這很可能是高鐵肌紅蛋白還原酶的作用。Madhavi和Carpenter[15]研究報道稱，高鐵肌紅蛋白還原酶將MetMb還原的作用是依賴于NADH存在的，然而NADH在宰后的肉中的含量是逐漸減少的，宰后7d以后很難再檢測到NAD，因此宰后的肉雖然MRA值仍然保持一定的水平，但肉色穩定性卻難以維持。

圖1 4℃貯藏5d的背最長?。↙L）、腰大肌（PM）、半腱?。⊿T）的高鐵肌紅蛋白還原酶活力（MRA）Fig.1 Metmyoglobin reducing activity（MRA）of longissimus lumborum（LL），psoas major（PM），semitendinosus（ST）at 1，2，3，4，5d（4℃）

2.4 三種肌肉的MMb相對百分含量隨貯藏時間的變化

三種肌肉的MMb相對百分含量隨貯藏時間的變化見表4。三種肌肉的MMb含量隨貯藏時間變化的趨勢結果支持了紅度值a*和MRA的結果，三種肌肉的高鐵肌紅蛋白（MetMb）含量都隨著時間的延長而逐漸積累，其中腰大肌的MetMb百分含量顯著高于背最長肌和半腱肌（p＜0.05），隨著時間的延長腰大肌MetMb的增加量也高于其他兩種肌肉，背最長肌5d后MetMb含量增加了7.6%，半腱肌5d后MetMb含量增加了5.1%，腰大肌5d后MetMb含量增加了3.04%。從數據上看，半腱肌的顏色穩定性要高于背最長肌，因為氧合肌紅蛋白含量高于背最長肌，高鐵肌紅蛋白含量低于背最長肌。王永輝、馬麗珍[16]的研究表明肌肉中的氧分壓大小與高鐵肌紅蛋白的產生和積累有很大的相關性，把肉縱切開可以看到由里至外的不同顏色：表面因為與氧氣接觸充分而呈現鮮紅；中間因為氧分壓低而呈現一層薄薄的褐色；下層因為無氧而呈現暗紫色。因此一些抗氧化劑比如VC、VE、茶多酚等[17]，由于可以抑制肉中肌紅蛋白的氧化，對肉以及肉制品護色很有效果。

2.5 三種肌肉的耗氧率隨貯藏時間的變化

三種肌肉的耗氧率（OCR）隨貯藏時間的變化見表5，隨著貯藏時間的延長，三種肌肉的OCR都是逐漸降低的，其中腰大肌的呼吸強度最大，OCR值：PM＞ST＞LL，這與紅度值a*、MRA和MetMb百分含量的順序相反，即呼吸強度高的肉顏色穩定性越差，這與D R Mckenna的研究結果[14]一致。背最長肌4℃下OCR在5d后降低了109.77，25℃下OCR在5d后降低了194.95；半腱肌4℃下OCR在5d后降低了128.57，25℃下OCR在5d后降低了223.94；腰大肌4℃下OCR在5d后降低了186.19，25℃下OCR在5d后降低了338.38。這三種肉在25℃下ORC的下降值高于4℃近一倍，這可能是由于低溫下的呼吸強度要弱于室溫下的呼吸強度。不同肌肉的色澤穩定性差異是由于它們的肌纖維結構不同以及生物功能不同造成的，呼吸代謝更強的肌肉OCR更高，比主要依賴糖酵解代謝而非呼吸代謝的肌肉的色澤穩定性差[18]。Hunt和Hedrick的研究[19]表明，腰大肌含有更多的β-紅纖維（β-red fibers），而背最長肌則含有更多的α-白纖維（α-white fibers），且腰大肌含有更多的線粒體，所以OCR高于背最長肌和半腱肌。線粒體濃度增加，呼吸耗氧上升，進而降低了氧分壓，促使DeoMb生成和積累，DeoMb的穩定性不如OxyMb[20]，更易氧化成MetMb，使肉色變褐；同時，呼吸速率的增加，使線粒體奪取OxyMb的氧，也會促使DeoMb的生成和積累，而DeoMb穩定性不如OxyMb，更易氧化生成MetMb，促使肉色褐變。

表4 4℃貯藏5d的背最長?。↙L）、半腱?。⊿T）、腰大?。≒M）的MMb百分含量Table 4MMb form（%）of longissimus lumborum（LL），semitendinosus（ST），psoas major（PM）at 1，2，3，4，5d（4℃）

表5 4、25℃貯藏5d的背最長?。↙L）、半腱?。⊿T）、腰大?。≒M）的耗氧率（OCR）Table 5Oxygen consumption rate（OCR）of longissimus lumborum（LL），semitendinosus（ST），psoas major（PM）at 1，2，3，4，5d（4℃ and 25℃）

3 結論

牛肉的色澤穩定性與高鐵肌紅蛋白還原酶活力（MRA）和呼吸耗氧率都有關聯，而與pH的相關性不顯著，三種肌肉的色澤穩定性順序為：背最長?。↙L）＞半腱肌（ST）＞腰大?。≒M）。高鐵肌紅蛋白還原酶活性強的肌肉紅度值高，褐變緩慢，色澤穩定性高；而耗氧率低的肌肉色澤穩定性更高，耗氧率（OCR）的順序為腰大肌（PM）＞半腱?。⊿T）＞背最長肌（LL），與紅度值和MRA的順序相反。

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Effect of postmortem time on metmyoglobin reducing activity and oxygen consumption of different bovine muscles

XIE Li，GAO Xiao-guang，MIAO Jing，HU Wen-juan，DAI Rui-tong*
（College of Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0342-05

2011－12－27 *通訊聯系人

謝麗（1987-），女，碩士研究生，研究方向：畜產品科學。

國家自然科學基金項目（31071624）。