黑米花青苷復(fù)方膠囊對(duì)酒精性肝損傷的防治作用

路宏朝，王 琦，張 濤，王楊科，李新生

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中，723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西漢中，723000；3.陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000）

黑米花青苷復(fù)方膠囊對(duì)酒精性肝損傷的防治作用

路宏朝1，2，3，王 琦1，2，張 濤1，2，王楊科1，李新生1，2，3

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中，723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西漢中，723000；3.陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000）

目的：研究黑米花青苷復(fù)方膠囊在小鼠酒精性肝損傷中的防治作用。方法：建立小鼠酒精性肝損傷病理模型，分別灌胃低劑量、高劑量的黑米花青苷復(fù)方膠囊進(jìn)行治療，正常組灌胃蒸餾水，助懸劑組灌胃植物油。第12d，測(cè)定肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽（GSH）含量及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-lβ（IL-lβ）的水平，并進(jìn)行肝臟病理學(xué)觀察。結(jié)果：黑米花青苷復(fù)方膠囊能明顯提高肝組織中SOD的活力，對(duì)MDA起到直接清除作用；還可以提高GSH含量，降低TNF-α和IL-lβ的水平。病理組織學(xué)顯示，黑米花青苷膠囊能顯著改善肝細(xì)胞的脂肪變性。同時(shí)，助懸劑對(duì)藥物的效果沒有影響。結(jié)論：黑米花青苷復(fù)方膠囊能夠?qū)凭愿螕p傷的治療起到一定的效果。

花青苷復(fù)方膠囊，酒精性肝損傷，病理學(xué)，藥理學(xué)

Abstract：Established pathology model of alcoholic-induced liver injury in mice and cured by poured the black rice anthocyanin compound capsule in low concentration and high concentration into stomach，distilled water for the normal group and plant oil for the suspending agents group.The content of SOD，MDA，GSH and the levels of TNF-α&IL-lβ in liver homogenate were measured in the 12th day.Hepatic pathological examination was observed.The result showed that the black rice anthocyanin compound capsule could increase SOD activity obviously，clear MDA content directly in hepatic tissue，improve GSH content and reduce TNF-α&IL-lβ level and improve hepatic steatosis.At the same time，suspension agents basically had no influence on drug effect.Therefore the black rice anthocyanin compound capsule had a particular treatment effect on alcohol liver injury in mice.

Key words：black rice anthocyanin compound capsule；alcoholic-induced liver injury；pathology；pharmacology

黑米具有滋陰補(bǔ)腎、健脾肝、明目活血之功效，因此黑米又有“補(bǔ)血米”、“長壽米”的美稱[1]?；ㄇ嘬帐怯苫ㄇ噜づc各種糖以糖苷鍵結(jié)合形成的糖苷，存在于黑稻的果實(shí)、莖、葉器官的細(xì)胞液中[2-3]，是黑米顏色的主要來源。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，黑米花青苷是一種較安全的天然色素資源，兼具有一定的營養(yǎng)和藥理作用[4-8]。胡秋林[9]以純化的黑米色素為材料，用小白鼠做動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明黑米花青苷能提高其抗疲勞能力和抗缺氧能力。秦玉[10]等研究發(fā)現(xiàn)黑米花色苷提取物膠囊具有明顯的輔助降血脂作用。楊靖亞[11]等認(rèn)為花青素是黃酮類化合物，具有很好的抗氧化效果，能有效地抑制癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。Zhang[12]等研究發(fā)現(xiàn)黑米的抗氧化作用與其中所含的黃酮和花青苷類物質(zhì)關(guān)系密切。而黑米花青苷是否因其抗氧化和抗自由基作用在肝臟損傷中起到保護(hù)作用，目前報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠酒精性肝損傷病理模型，采用項(xiàng)目組前期研制的黑米花青苷復(fù)方膠囊[13]進(jìn)行治療，探索黑米花青苷復(fù)方膠囊預(yù)防酒精性肝病的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑米花青苷復(fù)方膠囊 陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研究中心研制并提供，低劑量：含有效成分（黑米花青苷、二苯乙烯苷、菌多糖等）63.098mg/粒；高劑量：含有效成分（黑米花青苷、二苯乙烯苷、菌多糖等）88.339mg/粒[13]；助懸劑 金龍魚大豆油；考馬斯亮藍(lán)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白介素-lβ（IL-lβ）試劑盒 北京科盈美科技有限公司；KM小鼠 體重18～22g，雄性，體質(zhì)健康，毛色光滑雪白，購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院。

玻璃勻漿管，微量移液器，臺(tái)式離心機(jī)，可見分光光度計(jì)N772，酶標(biāo)儀，石蠟切片機(jī)，顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 將動(dòng)物隨機(jī)分為六組：正常組、模型組、助懸劑Ⅰ組、助懸劑Ⅱ組、低劑量組、高劑量組，每組10只，置于通氣良好的室內(nèi)給予充足食物進(jìn)行分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 酒精性肝損傷病理模型建立 通過連續(xù)11d對(duì)模型組、低劑量組、高劑量組小鼠灌胃50%的酒精0.3mL，建立酒精性肝損傷模型；同時(shí)，正常組和模型組每天灌胃蒸餾水0.3mL，助懸劑Ⅰ組灌胃植物油0.95mg/kg/d，助懸劑Ⅱ組灌胃植物油0.57mg/kg/d，低劑量組灌胃低劑量藥物3.78mg/kg/d，高劑量組灌胃高劑量藥物5.27mg/kg/d。第12d，停止灌胃，處死。

1.2.3 肝組織勻漿相關(guān)指標(biāo)及測(cè)定 取肝臟制備肝組織勻漿液，檢測(cè)肝組織中蛋白質(zhì)含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量，腫瘤壞死因子-α和白介素-lβ水平，均按試劑盒說明操作。

1.2.4 肝臟病理學(xué)檢查 取肝組織用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，普通光鏡觀察。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 原始數(shù)據(jù)通過SPSS11.0軟件中的ANOVA程序處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝組織中SOD活力和MDA含量

與正常組比較，模型組小鼠肝組織勻漿中SOD的活性顯著降低，MDA的含量顯著上升。與模型組比較，黑米花青苷復(fù)方膠囊低劑量和高劑量能顯著升高小鼠肝臟中SOD活性，顯著降低MDA的含量；兩助懸劑組相對(duì)于正常組，SOD活力和MDA的含量差異不顯著（見表1）。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，模型組的GSH含量較低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩助懸劑組與正常組差異不顯著；與模型組比較，黑米花青苷復(fù)方膠囊低劑量和高劑量組都能顯著提高肝組織中GSH的含量（見表2）。

2.2 肝組織中TNF-α、IL-1β的水平

表1 肝組織中SOD的活力和MDA的含量（±s）Table 1 Changes of SOD activity and MDA content in liver tissue（±s）

表1 肝組織中SOD的活力和MDA的含量（±s）Table 1 Changes of SOD activity and MDA content in liver tissue（±s）

注：與正常組比較ap＜0.05，aap＜0.01；與模型組比較bp＜0.05，bbp＜0.01；表2同。

分組 SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mL）正常組 67.66±3.98bb 2.24±0.57bb模型組 48.17±5.80a 4.64±0.52aa助懸劑Ⅰ組 60.21±7.68bb 1.66±0.37bb助懸劑Ⅱ組 64.19±9.72bb 1.60±0.12bb低劑量組 66.00±1.96bb 2.14±0.44bb高劑量組 67.82±6.05bb 1.87±0.51bb

表2 肝組織中GSH的含量、TNF-α、IL-1β的水平（±s）Table 2 Changes of GSH content and TNF-α、IL-1β level in liver tissue（±s）

表2 肝組織中GSH的含量、TNF-α、IL-1β的水平（±s）Table 2 Changes of GSH content and TNF-α、IL-1β level in liver tissue（±s）

分組 GSH（mg/mL） TNF-α（pg/mL） IL-1β（pg/mL）正常組 2.39±0.15 18.94±1.50 67.55±30.68b模型組 1.84±0.60 21.22±2.89 100.96±27.65a助懸劑Ⅰ組 2.26±0.32 15.54±2.82abb 83.89±12.70助懸劑Ⅱ組 2.81±0.41 16.01±1.56bb 58.46±9.26bb低劑量組 3.80±1.23abb 12.85±2.45aabb 84.27±20.36高劑量組 4.53±1.36aabb 10.91±1.17aabb 70.39±23.67b

與模型組比較，低劑量組、高劑量組TNF-α水平差異極顯著；低劑量組IL-1β水平差異不顯著，而與高劑量組差異顯著（見表2）。兩助懸劑組與正常組比較，TNF-α、IL-1β的水平差異都不顯著（見表2）。

2.3 肝組織病理變化

正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞條索明顯，無變性壞死、炎性細(xì)胞細(xì)胞浸潤以及纖維組織增生，具體見圖1（a）。模型組肝細(xì)胞條索紊亂，小葉邊緣呈纖維化，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞膜破損，胞漿疏松，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的脂肪空泡，炎性細(xì)胞細(xì)胞浸潤，膽汁大量淤積，小葉內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)點(diǎn)狀壞死，如圖1（b）所示。助懸劑Ⅰ組和助懸劑Ⅱ組肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無明顯變性，如圖1（c）、1（d）所示。低劑量組肝細(xì)胞條索狀不明顯，脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤均較模型組減輕，無大片狀壞死，如圖1（e）所示。高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索無明顯異常，接近正常狀態(tài)，無明顯病理變化，如圖1（f）所示。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)影響（HE）Fig.1 Hepatic tissue of mice from different groups（HE）

3 結(jié)果與討論

目前，酒精性肝病（ALD）已經(jīng)成為一種世界性疾病，發(fā)病率每年呈上升趨勢(shì)，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。機(jī)體攝入的酒精90%～95%都是在肝臟中進(jìn)行代謝，主要機(jī)制是通過產(chǎn)生過量氧自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化及肝細(xì)胞損傷[14]。本實(shí)驗(yàn)采用50%酒精灌胃的方法建立小鼠酒精性肝損傷模型，11d后，肝臟中的MDA的水平顯著升高，SOD含量顯著下降。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，肝臟出現(xiàn)纖維化，肝細(xì)胞脂肪變性明顯，并伴有炎性細(xì)胞浸潤、壞死。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了小鼠酒精性肝損傷模型。

本實(shí)驗(yàn)中，低劑量組和高劑量組小鼠肝臟中SOD的活力顯著升高，且隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，表明黑米花青苷復(fù)方膠囊可誘導(dǎo)SOD的表達(dá)，提高機(jī)體清除自由基的能力。MDA含量的高低直接反映肝臟中脂質(zhì)過氧化損傷程度，低劑量和高劑量藥物都能顯著降低肝臟中的MDA含量。說明黑米花青苷復(fù)方膠囊對(duì)肝臟的保護(hù)作用可能與增強(qiáng)機(jī)體清除自由基及抑制自由基反應(yīng)的能力、防止過度脂質(zhì)過氧化有關(guān)。但高劑量組與低劑量組之間沒有差異。GSH作為機(jī)體細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化組分，參與自由基的清除。長期飲酒者，肝細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量明顯降低或耗竭，以線粒體最為明顯，從而加劇了線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損害。本研究通過測(cè)定GSH含量來反映谷胱甘肽過氧化物酶（GSH—PX）活性的高低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑米花青苷復(fù)方膠囊低劑量和高劑量都可以顯著提高GSH的活性，由此可分析，黑米花青苷復(fù)方膠囊保肝作用可能還與其能夠維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)有關(guān)。

TNF-α和IL-1β是介入ALD損傷的重要炎癥因子。在肝臟中TNF-α主要由激活的Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生，而酒精可間接激活Kupffer細(xì)胞[15]。TNF-α?xí)鹪S多與肝損傷有關(guān)的介質(zhì)如IL-1β的出現(xiàn)，同時(shí)誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)產(chǎn)生。另一方面，酒精誘導(dǎo)的TNF-α的肝再生功能被逆轉(zhuǎn)，反而誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡。有研究表明，TNF-α基因被敲除的小鼠不會(huì)得酒精肝[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，低劑量組、高劑量組TNF-α水平都顯著下降，說明兩藥物具有減輕炎癥因子對(duì)肝細(xì)胞造成損傷的作用。IL-1β的水平只有在高劑量組中明顯降低，說明高劑量的藥物能夠減弱肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。同時(shí)組織學(xué)觀察，模型組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞膜破損，胞漿疏松，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，膽汁淤積，并伴有纖維化出現(xiàn)；低劑量和高劑量組癥狀都有所減輕，尤其高劑量組顯著地改善肝小葉變性、壞死的范圍和程度，進(jìn)一步表明，黑米花青苷復(fù)方膠囊對(duì)酒精所致的肝損傷具有一定保護(hù)作用。

本研究中兩助懸劑組灌胃植物油的量分別與低劑量組、高劑量組灌胃藥物中的植物油量相同。而與正常組比較，兩助懸劑組的SOD活力、MDA含量、GSH和TNF-α水平都沒有影響，同時(shí)病理組織學(xué)觀察，助懸劑組肝臟也無明顯病變，說明它們不影響黑米花青苷復(fù)方膠囊的效果。因此，選用此助懸劑是較為安全的。

綜上所述，黑米花青苷復(fù)方膠囊對(duì)小鼠酒精性肝損傷有較好的保護(hù)作用，但其確切機(jī)制尚需深入研究。

[1]孔令瑤.黑米中生物活性物質(zhì)的研究[D].無錫：江南大學(xué)，2008.

[2]曹小勇，李新生.黑米花色素苷類色素研究現(xiàn)狀及展望[J].氨基酸和生物資源，2002，24（1）：3-6.

[3]王鋒，鄧潔，譚興和，等.花色苷及其共色作用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2008，29（2）：472-476.

[4]Seok H N，Sun P C，Mi Y K，et al.Antioxidative activities of bran extracts from twenty one pigmented rice cultivars[J].Food Chemistry，2006，94：613-620.

[5]王艷龍，石紹福，韓豪，等.中國黑米花色苷研究現(xiàn)狀及展望[J].中國生化藥物雜志，2010，31（1）：63-66.

[6]李春陽，許時(shí)嬰，王璋.葡萄籽原花青素結(jié)構(gòu)單元的紅外光譜分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，24（4）：47-51.

[7]Li xingsheng，Long shuming，Wu sanqiao，et al.Investigation of anthocyanin extraction from black rice and light stability of anthocyanin-containing alcoholic drink[J].CIGR Journal，2011，13（Special issue）：151-159

[8]吳三橋，史隋孝，丁銳，等.黑米中花青苷色素的測(cè)定方法研究[J].氨基酸和生物資源，2002，24（3）：66-68.

[9]胡秋林.黑米色素藥理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告[J].武漢食品工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，12（3）：10-12.

[10]秦玉，凌文華.黑米花色苷提取物膠囊對(duì)高血脂癥病人的降血脂作用[J].食品科學(xué)，2008，29（10）：540-542.

[11]楊靖亞，吳宏忠，胡懌，等.天然抗氧化劑-抗癌轉(zhuǎn)移的新途徑[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12（4）：366-370.

[12]Zhang Ming wei，Guo Bao jiang，Chi Jian wei，et al．Antioxidations and their correlation with total flavones and anthocyanin contents in different black rice varieties[J]．Agric Sci China，2005，38（7）：1324-1334.

[13]石紹福.黑米花青苷組分分析及軟膠囊研制[D].漢中：陜西理工學(xué)院，2011.

[14]李業(yè)釗，李航.乙醇代謝酶與乙醇性肝損傷[J].醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（18）：2788-2791.

[15]Horie Y，Kato S，Ohki E，et al.Hepatic micro vascular dysfunctionin endotoxemie rats after acute ethanol administration[J].AlcoholClin Exp Re，2000，24（5）：691-698.

[16]Kishore R，Hill J R，McMullen M R，et al.ERK 1/2 and Egr-1contribute to increased TNF-alpha production in rat Kupffercellsafterchronic ethanolfeting[J].Am JPhysiol Gastrointest LiverPhysiol，2002，282（1）：6-15.

Preventive and curative effect of black rice anthocyanin compound capsule on alcohol-induced liver injury

LU Hong-zhao1，2，3，WANG Qi1，2，ZHANG Tao1，2，WANG Yang-ke1，LI Xin-sheng1，2，3
（1.School of Biological Science Technology and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China；2.Shaanxi Key Laboratory of Bio-Resources，Hanzhong 723000，China；3.Shaanxi Province Black Organic Food Engineering Technology Research Center，Hanzhong 723000，China）

TS201.4

A

1002-0306（2012）16-0347-03

2011－12－27

路宏朝（1980-），女，碩士，講師，主要從事動(dòng)物病理生理學(xué)方面的研究。

陜西省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（09JK249）；陜西省發(fā)改委陜南突破發(fā)展項(xiàng)目（08SNTPZX-HZ01-1）；陜西省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)研究計(jì)劃項(xiàng)目（06KJZ-06）。