DNA的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展

王曉亮，王星宇，梁長城，董 平，梁興國

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

DNA的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展

王曉亮，王星宇，梁長城，董 平，梁興國*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

作為一種等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)，滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification，RCA），以其簡單和高效的特點(diǎn)得到了廣泛的研究和應(yīng)用。一般通過與靶序列進(jìn)行雜交，特異性地生成環(huán)狀DNA來達(dá)到DNA檢測的目的。RCA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于免疫檢測、原位檢測、SNP檢測等方面。本文將對RCA的工作原理、技術(shù)進(jìn)展、應(yīng)用前景以及存在的問題等進(jìn)行介紹。

核酸檢測，恒溫核酸擴(kuò)增，滾環(huán)擴(kuò)增，鎖式探針，核酸復(fù)制

Abstract：As an isothermal DNA amplification technology，the well-known RCA （rolling circle amplification） has gained wide attention for its simplicity and high efficiency.Generally，forming specifically the circular DNA through hybridizing to the target molecule is the key point to realize specific detection.RCA has been extensively applied to immunoassay，in situ detection，SNP investigation and microarray assay.This review would introduce the principle，technological development，applicable prospect and the present problems of RCA.

Key words：nucleic acid detection；isothermal nucleic acid amplification；RCA；padlock probe；nucleic acid replication

核酸擴(kuò)增是一項基本的現(xiàn)代生物技術(shù)，不僅在生命科學(xué)各個領(lǐng)域的科學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用，并且在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、取證等各個方面都得到了廣泛應(yīng)用。眾所周知，上世紀(jì)八十年代發(fā)展起來的PCR（Polymerase chain reaction），作為第一個體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，對現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展起到非常重要的作用，可以說PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。但是PCR方法仍然有不足之處如：擴(kuò)增過程中需要對雙鏈DNA進(jìn)行變性、需要特制的可快速升降溫的PCR儀、因非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果等。因此，近十幾年來發(fā)展起來了一些新的核酸擴(kuò)增技術(shù)以取代PCR技術(shù)或彌補(bǔ)它的不足。如：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA）、基于核酸序列的擴(kuò)增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、鏈置換擴(kuò)增（Strand displacement amplification，SDA）和依賴解旋酶的擴(kuò)增（Helicase-dependent amplification，HAD）等。這些方法各有所長，綜合利用這些技術(shù)將使便攜式核酸檢測裝置等的開發(fā)成為可能。滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）技術(shù)以其簡單和高效的特點(diǎn)受到了越來越多的重視。由于引物可以連接于抗體等其他生物大分子上，使?jié)L環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生的信號可固定于基質(zhì)；引物也可以固定于固相基質(zhì)，使其與DNA芯片技術(shù)結(jié)合并使高通量檢測成為可能，例如進(jìn)行微陣列上的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）檢測。國外關(guān)于RCA技術(shù)的綜述文章多見于2006年以前，主要介紹RCA在生物技術(shù)領(lǐng)域的具體應(yīng)用方法。最近幾年，RCA已在納米材料、生物傳感器和功能性核酸的制備等領(lǐng)域有很多應(yīng)用[1]。國內(nèi)雖然也有綜述文章發(fā)表，但都只是進(jìn)行了簡單的介紹，而且對于RCA技術(shù)存在問題的闡述也不夠詳細(xì)，例如高靈敏度和高特性的矛盾，要很好地解決還需巧妙的分子設(shè)計；RCA技術(shù)的廣泛應(yīng)用還有賴于其自身的發(fā)展以及同其他高新技術(shù)（如納米技術(shù)，表面修飾技術(shù)，高靈敏度熒光檢測技術(shù)等）的有機(jī)結(jié)合[2]。本文對RCA技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)行較全面的介紹與分析，著重介紹其存在的問題和發(fā)展前景，以期對大家開發(fā)和應(yīng)用新的核酸擴(kuò)增技術(shù)有所啟發(fā)。

1 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)

1.1 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)簡介

滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展于上世紀(jì)九十年代中期，幾個研究小組證實[3-5]，以幾十個堿基長的單鏈環(huán)狀DNA為模板，在具有鏈置換性的DNA聚合酶的作用下，可以產(chǎn)生與環(huán)狀DNA模板互補(bǔ)的單鏈DNA序列（圖1a）。Lizardi等最先將結(jié)合鎖式探針的滾環(huán)擴(kuò)增應(yīng)用于突變檢測[6]，發(fā)展了使用單條引物的線性RCA和使用雙引物的指數(shù)RCA（圖1b）。

圖1 RCA擴(kuò)增與DNA檢測原理Fig.1 Principle of RCA amplification and DNA detection

線性RCA又稱單引物RCA，一條結(jié)合于環(huán)狀DNA模板的引物沿著環(huán)延伸，產(chǎn)物為單環(huán)長度的數(shù)千倍的串聯(lián)重復(fù)拷貝，最高可產(chǎn)生105倍的擴(kuò)增[7]。線性RCA技術(shù)由于產(chǎn)物始終連接在起始引物上，所以信號易于固定是它的一大優(yōu)勢，非常適合于微陣列上的擴(kuò)增檢測。

指數(shù)RCA，也被稱作超分支擴(kuò)增HRCA（Hyper branched RCA）或RAM（Ramified RCA）[8-10]，可使目標(biāo)物擴(kuò)增109倍以上，甚至實現(xiàn)單分子的核酸檢測[11-13]。在指數(shù)RCA中，一條引物擴(kuò)增出RCA產(chǎn)物，第二條引物與RCA產(chǎn)物雜化并延伸，置換已經(jīng)結(jié)合在RCA產(chǎn)物上的下游引物延伸鏈，反復(fù)進(jìn)行延伸和置換，產(chǎn)生樹狀的RCA擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1b）[14]。在指數(shù)RCA擴(kuò)增過程中引入或產(chǎn)生新的環(huán)狀DNA作為模板，可以進(jìn)行下一輪的RCA反應(yīng)，進(jìn)一步提高擴(kuò)增的靈敏度[15]。

1.2 特異性成環(huán)-RCA技術(shù)進(jìn)行核酸檢測的關(guān)鍵

利用RCA技術(shù)進(jìn)行基因診斷，關(guān)鍵是特異性地生成環(huán)狀DNA。即只在有檢測對象存在的條件下方可成環(huán)，而且只有成環(huán)的DNA才能進(jìn)行擴(kuò)增。一般將幾十個堿基長的寡核苷酸，部分雜化到目標(biāo)DNA上以后，使寡核苷酸的兩末端相鄰，形成一個縫隙（Nick），經(jīng)過連接酶連接后形成閉合環(huán)狀DNA（圖2）。這一過程類似于將DNA分子特異性地鎖定在目標(biāo)DNA上，因此所用寡核苷酸探針被稱作鎖式探針（Padlock-probe）。理論上只有鎖式探針的兩端與檢測對象的序列完全互補(bǔ)才能成環(huán)，但是在實際應(yīng)用中，當(dāng)離開連接處較遠(yuǎn)的部位出現(xiàn)不互補(bǔ)的堿基對時，探針也會成環(huán)，RCA擴(kuò)增也會進(jìn)行，造成假陽性的結(jié)果。尤其是在使用忠實度較低的T4 DNA連接酶時，甚至在沒有任何靶序列作為模板的情況下也會成環(huán)[16]。為了提高成環(huán)的特異性，可以采用耐熱性連接酶（如Ampligase，Taq ligase）在較高溫度下進(jìn)行連接[6，17]。有時需要進(jìn)一步提高其特異性，如區(qū)分單核苷酸多態(tài)性。圖3所示的改進(jìn)方法可以達(dá)到檢測SNP的要求，雜化后留一個6～10nt長的大缺口（Gap），只有另外一條短DNA與靶序列的缺口處完全互補(bǔ)時才能成環(huán)[6]。由于這條短DNA鏈中只要有一個錯配，就不會雜化，特異性得到了很大提高。

圖2 鎖式探針的特異性環(huán)化Fig.2 Specific circularization of the pad-lock probe

圖3 中部留有一個大缺口的探針成環(huán)方式Fig.3 Circularization with a big gap at the middle position

在使用RCA技術(shù)檢測雙鏈DNA時，一般要對DNA進(jìn)行高溫變性，這無疑會增加非特異性成環(huán)和非特異性擴(kuò)增的可能性。為了解決這個問題，Smolina等人使用特殊序列的PNA（Peptide nucleic acid）在不使雙鏈DNA變性的條件下實現(xiàn)了特異性成環(huán)[18]。如圖4所示，只在特定的部位通過與雙鏈DNA中的一條鏈形成三螺旋（Triplex）而把DNA雙鏈打開以形成DNA-loop，然后再將C-loop（Circular loop）在此部位連接成環(huán)。也可以先用一條被稱作Capture probe的DNA將相關(guān)序列固定于固體或粒子表面，再進(jìn)行RCA反應(yīng)[11]。這樣可以通過洗脫除去沒有成環(huán)的非目標(biāo)DNA，來提高檢測的特異性。當(dāng)用來檢測較短的微小RNA（Mircro RNA）時，RNA可以直接作為引物進(jìn)行線性RCA反應(yīng)，即使在較長的非目標(biāo)核酸（雜化處無自由的3’末端）上通過部分錯配成環(huán)，所成環(huán)也不能進(jìn)行RCA擴(kuò)增，從而保證了檢測反應(yīng)的忠實度[19-20]。

圖4 PNA-opener用于原位檢測的原理Fig.4 Principle of PNA-opener for in situ detection

1.3 高效RCA反應(yīng)的技術(shù)要求

從RCA的擴(kuò)增機(jī)理可以看出，無論是線性RCA還是指數(shù)型RCA，都要求DNA聚合酶具有很強(qiáng)的持續(xù)性（Good processivity）和鏈置換（Strand-displacement）能力。Phi29、Phage T7和Sequenase等聚合酶都可以滿足以上要求[5]。其中Phi29聚合酶的效率最高，可以在30min內(nèi)對靶核酸分子的擴(kuò)增達(dá)到1000倍。但由于Phi29等聚合酶有較強(qiáng)的外切酶活性，有時需要對引物進(jìn)行修飾以避免被降解。RCA反應(yīng)也可以在熱穩(wěn)定性的聚合酶如Vent（exo-）和Bst DNA polymerase的作用下高溫進(jìn)行，但同時也容易發(fā)生非特異性的擴(kuò)增[21-22]。有時加入可以同單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)有利于提高RCA反應(yīng)的效率。

鎖式探針的長度一般為30～100nt。過短則DNA雙螺旋很難彎曲，在進(jìn)行RCA過程中將會產(chǎn)生較大的張力和拓?fù)渥枇?，降低RCA的反應(yīng)效率。擴(kuò)增過程中生成的DNA將不斷纏繞在環(huán)狀DNA上，環(huán)過小將使擴(kuò)增中途停滯[23]，環(huán)過大時，拓?fù)湔系K不復(fù)存在，但擴(kuò)增的倍數(shù)將成比例降低，尤其對指數(shù)RCA影響較大。只要引物和DNA環(huán)結(jié)合，聚合酶的強(qiáng)大催化能力使RCA反應(yīng)可在單分子水平進(jìn)行。但是，當(dāng)靶核酸濃度較低（fmol/L或amol/L數(shù)量級）時，成環(huán)反應(yīng)一般要求探針的濃度較高（nmol/L數(shù)量級）。另一方面，加入較高濃度的待成環(huán)DNA探針，會產(chǎn)生非特異性成環(huán)和生成探針線性二聚體（兩個探針分子在一個靶物分子上連接）等問題。使用較高濃度的高反應(yīng)活性連接酶也有利于提高靈敏度，但同時也會使非特異性成環(huán)的概率增加。可以看出，在實際應(yīng)用中靈敏度和高特異性總是一對矛盾，需根據(jù)具體情況合理選擇反應(yīng)條件。

1.4 RCA反應(yīng)產(chǎn)物的檢測

傳統(tǒng)的RCA反應(yīng)與PCR最大的不同在于：PCR靠引物本身與模板的特異性結(jié)合實現(xiàn)擴(kuò)增的特異性；而RCA只是對加入的探針（C-probe）進(jìn)行擴(kuò)增。在用RCA進(jìn)行基因檢測時，一般靶序列的有無決定探針是否成環(huán)并進(jìn)行RCA擴(kuò)增。因此一旦成環(huán)，RCA擴(kuò)增就會順利進(jìn)行，這往往是假陽性產(chǎn)生的重要原因。

檢測RCA擴(kuò)增產(chǎn)物的常規(guī)方法是凝膠電泳。線性RCA產(chǎn)物在凝膠電泳上呈現(xiàn)彌散狀分布，指數(shù)RCA產(chǎn)物在凝膠電泳上的圖樣呈現(xiàn)階梯狀。在預(yù)先設(shè)計的鎖式探針上引入限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，將RAM信號擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過酶切后進(jìn)行凝膠電泳，就會呈現(xiàn)單一條帶[13]。同時在RCA反應(yīng)中，也可以加入SYBR Green等染料對RCA反應(yīng)進(jìn)行實時檢測。但SYBR Green染色無特異性，同非目的核酸結(jié)合也發(fā)出熒光，因此在使用過程中，應(yīng)注意避免背景被核酸污染。

采用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針可特異性檢測RCA擴(kuò)增產(chǎn)物。只有與標(biāo)記的探針互補(bǔ)的DNA產(chǎn)物才能產(chǎn)生檢測信號，有很好的特異性。常用的探針有分子信標(biāo)（Molecular Beacon）、分子拉鏈（Molecular Zipper）等[24-26]。其中分子信標(biāo)主要用于檢測線性RCA；而分子拉鏈主要用于指數(shù)RCA的檢測。分子拉鏈含有兩條長度不同的寡核苷酸鏈，短鏈的3’末端接有一個熒光分子，長鏈的5’端帶有熒光淬滅基團(tuán)。兩條鏈雜化后形成帶有單鏈突出末端（Overhang）的雙螺旋，而且熒光分子和淬滅基團(tuán)相鄰抑制熒光產(chǎn)生。在RCA過程中，突出的3’末端作為引物參與RCA反應(yīng)，這樣擴(kuò)增過程中短鏈被置換下來，熒光發(fā)射基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離而產(chǎn)生熒光，生成可以檢測到的信號。

以納米金粒子標(biāo)記的DNA探針還可以實現(xiàn)目測檢測[27]。Li等利用毛細(xì)管電泳方法檢測RCA產(chǎn)物，可以檢測到少于2fmol的RCA產(chǎn)物[28]。Hu等用納米金探針標(biāo)記RCA產(chǎn)物后，利用表面增強(qiáng)拉曼光譜對產(chǎn)物進(jìn)行高靈敏度檢測[29]。即使有一個堿基的差別，也可以被識別，顯示了較高的特異性。Long等將RCA產(chǎn)物固定于固相磁珠表面，利用電化學(xué)的方法檢測RCA產(chǎn)物，最低能夠檢測到10amol/L的目標(biāo)DNA和大約0.2pg/μL的基因組DNA[30]。

1.5 利用RCA技術(shù)進(jìn)行環(huán)狀基因組的全擴(kuò)增

在生命科學(xué)領(lǐng)域，對基因組內(nèi)所有的DNA進(jìn)行同比例的全擴(kuò)增（全基因組DNA擴(kuò)增）越來越受到重視。最初全基因組擴(kuò)增方法主要依靠大腸桿菌宿主體內(nèi)自然擴(kuò)增和PCR反應(yīng)。采用宿主體內(nèi)擴(kuò)增的缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，擴(kuò)增周期長，而基于PCR的全基因組擴(kuò)增方法經(jīng)常導(dǎo)致非專一性擴(kuò)增和染色體位點(diǎn)缺失，擴(kuò)增產(chǎn)物量也較少[31-34]。RCA技術(shù)也可以用于基因組全擴(kuò)增。對于大的環(huán)型DNA模板，例如質(zhì)粒、噬菌體DNA、葉綠素和線粒體DNA等，采用多個引物或隨機(jī)性引物進(jìn)行指數(shù)RCA反應(yīng)，可以達(dá)到較高質(zhì)量的全擴(kuò)增[35]。Amersham Biosciences公司的Templiphi DNA測序模板擴(kuò)增試劑盒能夠在幾小時內(nèi)從皮克量的起始材料得到微克量的DNA。由于Phi29 DNA聚合酶的高保真率和高延伸性使得擴(kuò)增產(chǎn)物的長度和染色體位點(diǎn)保留都得到了極大提高，擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接用于測序[36]。

根據(jù)指數(shù)RCA類似的原理，使用隨機(jī)序列的多種引物可對線性全基因組進(jìn)行全擴(kuò)增。Dean等人使用核酸酶抗性隨機(jī)引物和Phi29 DNA聚合酶進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，在30℃反應(yīng)6h，能夠從少至10個拷貝的基因組DNA中擴(kuò)增DNA至20～30μg，產(chǎn)物的平均長度大于10kb[37]。這種方法甚至可以從全血樣品中較均勻地擴(kuò)增人類基因組DNA。對于降解較嚴(yán)重的DNA樣品，Wang等開發(fā)了一種改進(jìn)的全基因組擴(kuò)增技術(shù)，RCA-RCA（限制性酶切和輔助環(huán)化滾環(huán)擴(kuò)增）[38]，即先使用限制性內(nèi)切酶去降解DNA成小的片段，然后進(jìn)行環(huán)化，再加入隨機(jī)引物進(jìn)行指數(shù)RCA擴(kuò)增，擴(kuò)增效果相對于以往方法有了很大改善。

2 RCA在傳統(tǒng)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

RCA技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢在基因檢測、基因診斷、原位檢測、免疫檢測和微陣列固相檢測等領(lǐng)域表現(xiàn)出了極大的應(yīng)用潛力。這些領(lǐng)域中的大量相關(guān)研究開辟了RCA技術(shù)良好的應(yīng)用前景。

原位檢測技術(shù)是利用核酸雜交方法，特異地與細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)核酸進(jìn)行結(jié)合并用顯微鏡觀測目標(biāo)核酸的位置[39]。Schweitzer和Wiltshire等研究小組利用RCA技術(shù)對傳統(tǒng)的免疫測定技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)[40-41]。具體有以下四個步驟：a.樣品蛋白被固定在芯片上的抗體捕捉；b.生物素化（Biotinylated）的二次抗體與被捕捉的樣品蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合；c.帶有引物的通用抗體和二次抗體結(jié)合；d.加入環(huán)狀DNA進(jìn)行RCA信號擴(kuò)增。近來也有研究小組利用篩選的適配體（Aptamer）和被檢測蛋白直接親和，然后進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增Aptamer的檢測方法，能夠省去繁雜的蛋白親和過程[42]。Nilsson最初研究利用鎖式探針檢測細(xì)胞中期和間期的染色體[7]。后來Christian研究小組等利用限制性內(nèi)切酶處理細(xì)胞內(nèi)的雙鏈目標(biāo)模板，使得用于探針結(jié)合的單鏈模板暴露，原位檢測的準(zhǔn)確度有了很大提升[43]。Somlina等人利用兩個PNA openers打開雙鏈DNA中的特定序列用于探針結(jié)合，省去了多步驟的酶切處理過程，簡化了操作，同時也保證了準(zhǔn)確性[18]。但是此方法只有在易形成三螺旋（Triplex）的特殊序列處才可使用，有一定的局限性。

基于SNP在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)中的重要地位，快速、高通量、廉價的SNPs分型方法有著廣闊的應(yīng)用前景。RCA技術(shù)可以很好地滿足這些要求。Faruqi等通過特殊設(shè)計的鎖式探針，縮短3’端的雜交臂長，升高雜交溫度，可達(dá)到1∶100000的SNPs等位基因識別率[25]。由于采用了強(qiáng)力的擴(kuò)增手段和高效的實時檢測方法，使得研究者可以從1.0ng的基因組DNA中檢測出SNP。Pickering等采用相同的方法，能夠從單個同源基因中對所有等位基因?qū)崿F(xiàn)同步檢測[44]。

在檢測單核苷酸多態(tài)性和新近出現(xiàn)的檢測MicroRNA方面，RCA技術(shù)也具有顯著的優(yōu)勢[45]。RNAi和各種小RNA調(diào)節(jié)作用的發(fā)現(xiàn)使人們開始重新審視RNA的功能，并有發(fā)現(xiàn)RNA新大陸的說法。因此小RNA的檢測引起了人們的廣泛關(guān)注。目前利用鎖式探針檢測MicroRNA的方法主要有三種形式：a.只是利用目標(biāo)RNA作為引發(fā)引物進(jìn)行擴(kuò)增，鎖式探針預(yù)先利用單鏈連接酶連接成環(huán)[19-20]；b.鎖式探針以目標(biāo)RNA為模板成環(huán)，同時目標(biāo)RNA作為引物進(jìn)行擴(kuò)增[46-47]；c.預(yù)先反轉(zhuǎn)錄目標(biāo)RNA，再利用反轉(zhuǎn)錄的DNA為模板進(jìn)行RCA反應(yīng)[48]。在以RNA為模板進(jìn)行成環(huán)時，連接酶T4 RNA Ligase2較T4 DNA Ligase具有更高的特異性[46-47]。

Murakami等研究出了一種新的檢測MicroRNA的方法，稱作Primer-generation RCA（PG-RCA）[49]。它依靠MicroRNA模板特異性地產(chǎn)生可用作鎖式探針的引物，同時在引物中引入酶切位點(diǎn)使得RCA的效率得到極大的提高，能夠特異性地檢測到濃度為15.9zmol的MicroRNA分子。另外Lagunavicius等[50]證明Phi 29 DNA聚合酶具有3’→5’單鏈RNA外切核酸酶活性，能夠?qū)⒛繕?biāo)RNA轉(zhuǎn)化成擴(kuò)增引物。Merkiene等利用E.Coli RNase III專一性輔助Phi29 DNA聚合酶，先將目標(biāo)RNA和探針的雜交物進(jìn)行RNase III處理，隨后加入Phi29 DNA聚合酶，進(jìn)行RCA產(chǎn)物延伸[51]。這種方法特異性良好，適用于待檢測的RNA序列遠(yuǎn)離其3’末端時的檢測。

芯片上的DNA擴(kuò)增可以實現(xiàn)高通量檢測。Nallu等利用RCA反應(yīng)擴(kuò)增固定于微陣列上的引物，能夠在微陣列芯片上檢測到最低濃度480fmol/L的固定引物，比相同條件下均相中的雜交反應(yīng)敏感度增加了8000倍[52]。同時在微陣列上進(jìn)行SNP檢測，比不采用RCA的直接雜交檢測的靈敏度提高2個數(shù)量級（1nmol/L到10pmol/L）。但如何將大量不同序列的待檢測引物在芯片上固定仍是一大難題。如果能在芯片上特異性成環(huán)并進(jìn)行特異性擴(kuò)增，無疑將大大拓展這一技術(shù)的應(yīng)用前景。

目前RCA技術(shù)已經(jīng)有被應(yīng)用到食品中的例子，利用鎖式探針特異地與從食品中提取的轉(zhuǎn)基因模板雜交，連接成環(huán)后進(jìn)行RCA[53]。這種方法可以快速檢測進(jìn)出口食品中的轉(zhuǎn)基因成分，其特異性好，靈敏度高。利用RCA技術(shù)可檢測食品中的卵清蛋白，基于抗原抗體特異結(jié)合后利用RCA進(jìn)行擴(kuò)增[54]。也有研究者使用RCA檢測重金屬鉛，利用Aptamer同鉛離子的特異性結(jié)合，然后用RCA進(jìn)行信號擴(kuò)增以判斷目標(biāo)物的存在與否[55]。

3 核酸納米技術(shù)與RCA

納米技術(shù)與RCA技術(shù)結(jié)合可以取得非常好的檢測效果。有研究人員利用納米金結(jié)合的寡核苷酸探針來檢測滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物，操作簡便，靈敏度高[56]；Cheng等利用Quantum Dot來檢測RCA擴(kuò)增產(chǎn)物，將此種方法應(yīng)用于免疫測定，能夠檢測到100μL內(nèi)的16個樣品分子，在1.0amol/L到1.0pmol/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系[57]。除了納米級金屬材料應(yīng)用于滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測以外，納米級的生物材料也被應(yīng)用于滾環(huán)擴(kuò)增中。Lin等利用Aptamer和RCA技術(shù)結(jié)合檢測溶液中的ATP，最低能夠檢測到10μmol/L的ATP分子[58]。

Edda等利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增具有交叉結(jié)構(gòu)的DNA納米結(jié)構(gòu)分子，即以RCA技術(shù)制備DNA納米材料[59]。其團(tuán)隊引入一種限制性內(nèi)切酶輔助將RCA產(chǎn)物酶切成單個拷貝，然后利用連接酶連接成環(huán)，重復(fù)RCA擴(kuò)增和酶切過程，得到大量的目標(biāo)DNA分子。但是，RCA技術(shù)仍很難解決核酸納米材料在實際應(yīng)用上的諸多難題。

4 結(jié)論與展望

滾環(huán)擴(kuò)增作為一種高效的核酸擴(kuò)增手段，因其等溫特性和引物末端易固定的特點(diǎn)，既可實現(xiàn)溶液中的特異性擴(kuò)增，又可用于微陣列芯片進(jìn)行高通量檢測。在基因診斷與檢測、原位檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力使之可稱為具有廣泛應(yīng)用前景的先端生物技術(shù)。滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)引物設(shè)計簡單，產(chǎn)物分析手段多樣，符合后基因組時代核酸檢測的快速、準(zhǔn)確、高通量等要求。尤其是它可用于小RNA分子的檢測，在快速發(fā)展RNA研究領(lǐng)域可以得到較大的發(fā)展。而且RCA技術(shù)可方便地同納米技術(shù)、熒光探針、核酸芯片等技術(shù)相結(jié)合，使其應(yīng)用前景更廣闊。另一方面，目前RCA技術(shù)也存在難以同時達(dá)到高特異性、高靈敏度和高通量的問題。在實際應(yīng)用中也有操作繁瑣和成本高的弱點(diǎn)，難以取得巨大的經(jīng)濟(jì)效益，仍然需要進(jìn)行有針對性的深入研究以解決上述問題，最終使之成為強(qiáng)有力的技術(shù)工具。

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Research progress of rolling circle amplification of DNA

WANG Xiao-liang，WANG Xing-yu，LIANG Chang-cheng，DONG Ping，LIANG Xing-guo*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Q556

A

1002-0306（2012）14-0358-06

2012－03－10 *通訊聯(lián)系人

王曉亮（1986年-），男，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)。

“國家青年千人計劃”；“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃”；“山東省萬人計劃”。