術前熱療聯合灌注化療對肺癌細胞凋亡及相關基因的影響

祝淮陽 熊瑜

肺癌是一種嚴重危害人類健康的惡性疾病，其發病率和死亡率在世界范圍內居所有惡性腫瘤之首。其發生、發展和轉歸與細胞凋亡有密切關系，其實質是細胞增殖與凋亡的失衡，即增殖過度或凋亡不足。誘導癌細胞的凋亡，抑制其增殖已成為肺癌輔助治療的新策略。本研究對37例中晚期肺癌患者采用術前熱療聯合灌注化療，觀察凋亡調控基因p53表達、癌細胞凋亡的情況，現將結果報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 83例患者均來自2006年7月至2009年6月在我科治療的患者。診斷及入組標準:術前有胸部X線片及CT等的臨床診斷，經纖維支氣管鏡檢查并活檢(包括刷片)所得的病理診斷。術后均有切除標本的最后病理學診斷。術后的TNM分期采用2009年國際抗癌聯盟(UICC)的TNM分期修訂標準。中晚期非小細胞肺癌的確定標準為ⅢA期和ⅢB期肺癌，以及ⅡB期肺癌手術時發現肺門淋巴結融合固定而不能徹底清掃，又無條件行全肺切除，達不到根治性手術要求者。分為3組:術前熱療聯合灌注化療組(A組)37例，年齡45～70歲，行根治性肺癌切除31例，未達到根治手術標準共6例。術前灌注化療組(B組)31例，年齡45～70歲，術前行灌注化療，行根治性肺癌切除26例，未達到根治手術標準共5例。直接手術組(C組)15例，年齡45～65歲，僅行根治性肺癌切除14例，未達到根治手術標準共1例。3組之間患者年齡、性別、分期、分型等無統計學差異(P＞0.05)，具有可比性。見表1。

表1 3組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 介入灌注化療操作:A、B組術前1周均先經股動脈穿刺插管至支氣管動脈、鎖骨下動脈或肋間動脈造影，根據造影結果將導管超選擇性插入腫瘤供血動脈，注入化療藥物順鉑和絲裂霉素。根據患者一般情況及體表面積決定用藥量，一般順鉑80～100 mg，絲裂霉素14～20 mg。

1.2.2 熱療:使用珠海市和佳醫療設備有限公司HG-2000體外高頻熱療機，頻率為13.56 MHz，上下電極直徑均為17 cm，電壓200 V，功率3000 W，治療時間60 min/次，測溫系統由測溫傳感器和計算機組成，深度可達17～25 cm，溫度控制在41～44℃，機控輸出功率90% ～95%(計算機控制并與溫度相關，如大于此數值則溫度達44℃，如小于此數值則溫度＜41℃)。術前熱療聯合灌注化療組行介入灌注化療前1 h，用HG-2000體外高頻熱療機治療1次，溫度控制在41～44℃，注藥24 h后再次熱療1次，治療時間60 min/次。

1.2.3 主要試劑:即用型鼠抗人 p53、bcl-2、PCNA單克隆抗體及鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色超敏試劑盒，購自福州邁新生物技術開發公司。該試劑盒包括:即用型過氧化酶阻斷劑(試劑A)，即用型阻斷血清，10%非免疫動物血清(試劑B)，即用型生物素標記的第二抗體(試劑C)，即用型鏈霉菌素蛋白-過氧化酶溶液(試劑D)。

1.2.4 標本的收集和制片方法:A、B組所有病例于治療前經細針穿刺取材，手術中留取腫瘤組織標本。所取標本常規甲醛溶液固定，后脫水、透明、浸蠟、包埋。石蠟包埋，將每一癌組織蠟塊切片4張，厚為4 μm，1張常規HE染色，另3張采用鏈霉菌抗生物素過氧化物酶(streptavidin peroxidase conjugated methods，S-P)免疫組化法分別檢測癌組織中PCNA、bcl-2、p53蛋白的表達情況。

1.2.5 凋亡指數(AI)的計算:高倍鏡下(×400倍)分別觀察治療前后癌組織HE染色片10個視野，根據凋亡細胞的形態學特征識別凋亡細胞，其特征如下:(1)單個萎縮細胞，周圍有空暈;(2)核固縮;(3)濃縮的嗜酸性細胞質;(4)凋亡小體形成［1］。AI=(凋亡細胞數/癌細胞總數)×100%。

1.2.6 增殖指數(PI)的計算和bcl-2、p53染色結果的判斷:PCNA和p53為細胞核內著色，bcl-2為核膜和細胞質著色，光鏡下呈現黃到棕褐色為陽性。選取10個高倍視野(×400)，計算PCNA陽性細胞數所占比例作為PI，即PI=PCNA陽性細胞數/癌細胞總數×100%，用均數±標準差表示。bcl-2和p53染色結果規定:陽性細胞數≤10%，或背景同空白對照時為(-);10%＜陽性細胞數≤25%為(+);25% ＜陽性細胞數≤50%為(++);陽性細胞數＞50%為(+++)。

1.3 統計學分析 數據用SPSS 10.0統計軟件包作統計分析，計量資料采用配對t檢驗和方差分析，等級資料采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 A、B、C組手術前后癌細胞的AI、PI間的比較 3組治療前癌細胞的AI、PI差異無顯著性意義。A、B組病例治療后AI高于治療前，治療后PI低于治療前，差異有統計學意義(P＜0.01);A組與B組的AI均高于C組，A組的AI又高于B組，差異均有統計學意義(P均＜0.01);A組與B組的PI均低于C組，A組的PI又低于B組，差異均有統計學意義(P均＜0.01)。見表2。

表2 3組手術前后癌細胞的AI、PI間的比較(±s)

表2 3組手術前后癌細胞的AI、PI間的比較(±s)

注:與治療前比較，＊＊P＜0.01;與 C組比較，△△P＜0.01;與 B組比較，##P＜0.01

2.2 3組手術前后bcl-2、p53表達的變化 A組、B組病例治療前癌組織bcl-2、p53陽性表達差異無統計學意義(P＞0.05)，手術后癌組織bcl-2、p53陽性表達低于治療前，差異有統計學意義(P＜0.01);A組術后癌組織bcl-2、p53陽性表達低于B組，差異有統計學意義(P＜0.01);A組、B組病例治療前癌組織bcl-2、p53陽性表達較C組高，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表3。

表3 3組手術前后bcl-2、p53表達的變化(n)

3 討論

熱療是臨床腫瘤治療的一種重要手段，通過加熱腫瘤使其局部溫度升高達到41℃左右。腫瘤組織含水率高，組織內血液循環不良，因而散熱性差，其溫度升高比周圍正常組織更明顯，一般高出5℃左右，加之腫瘤細胞耐熱性差，當溫度升高至41℃時即可被殺死，而健康組織卻可耐受45℃的高溫，因此可以利用微波加熱來治療腫瘤［1］。熱療可以加強和協同化療藥物發揮作用，熱療與化療聯合應用具有明顯的增效互補和減少并發癥的作用［2］。

細胞凋亡是一種由內源性多基因控制的、主動的程序化細胞死亡過程，這種死亡方式可以與具有自我更新能力的組織通過有絲分裂不斷產生新細胞相平衡，因而對正常組織維持穩定具有重要作用。腫瘤的發生、進展取決于凋亡、增殖兩方面的因素，細胞凋亡受抑是腫瘤形成的原因之一。近年來大量研究表明，熱誘導細胞凋亡是熱療殺傷腫瘤細胞的主要機制［3］，在敏感組織中，加熱至42℃，30 min可以引起廣泛的細胞凋亡，而加熱到46℃或更高則產生壞死，且不同腫瘤對高溫反應差別很大［4］。

抗癌藥物具有誘導癌細胞凋亡，抑制其增殖的作用，動脈灌注化療已成為晚期肺癌的綜合治療措施。熱療技術作為惡性腫瘤新的治療手段，安全性高，無明顯的不良反應［5］，能夠在有效的溫度范圍內提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，逆轉腫瘤細胞的耐藥［6］，誘導腫瘤細胞發生凋亡［7］。同時熱療可致細胞內環境酸化，促進化療藥物誘發腫瘤細胞凋亡，與動脈灌注化療有明顯的協同作用。

研究表明，熱療和化療聯合對 A549細胞生長的抑制作用強于單純熱療和單純化療［8］，多集中在體外試驗，而較少臨床研究。本研究采取術前行熱療聯合灌注化療，取術前及術后病理組織進行研究，結果表明，術前熱療聯合灌注化療和術前灌注化療組術后癌組織的AI明顯升高，提示治療肺癌的臨床療效部分是通過促進腫瘤細胞的凋亡實現的，術前熱療組的AI明顯高于灌注組，提示熱療參與腫瘤細胞的凋亡，且與化療實現了協同作用。

隨著現代腫瘤熱療技術的發展，許多實驗研究已經證實熱療是一種非常理想的輔助治療手段，熱療可以直接誘導腫瘤細胞凋亡，并通過誘導p53的表達、下調凋亡抑制基因bcl-2的表達以利于細胞進入凋亡。

本研究采用術前熱療聯合灌注化療，充分發揮熱療與化療抗腫瘤的協同作用，旨在探討術前熱療聯合灌注化療對中晚期肺癌患者癌細胞凋亡和增殖的影響。由于AI、PI是評價腫瘤細胞凋亡程度和增殖活性的最常用的指標，治療后癌細胞AI、PI的變化亦可作為判斷治療敏感性和療效的標準［9］，因此我們研究提示:術前熱療聯合灌注化療能使肺癌癌細胞凋亡增加，增殖下降，是較理想的綜合治療方法之一。

bcl-2作為凋亡抑制基因，其蛋白產物可保護多種細胞免于各種誘因所致的細胞凋亡。p53是一種抑癌基因，在肺癌中突變頻率較高。正常的p53基因為野生型，發生突變者則稱為突變型。野生型p53抑制細胞增殖，促進細胞凋亡;而突變型p53功能與之相反，并可抑制野生型p53的抑癌活性，p53遂由抑癌基因轉為原癌基因。我們研究發現，A、B組治療前癌組織bcl-2、p53陽性表達較C組高，差異有統計學意義(P＜0.01)，說明bcl-2、p53陽性表達水平與肺癌的分期有關，和先前的研究一致。A、B組病例治療前癌組織bcl-2、p53陽性表達差異無統計學意義。A組、B組術后癌組織bcl-2、p53陽性表達低于治療前，差異有統計學意義(P＜0.01)。說明術前熱療聯合灌注化療能發揮抗腫瘤的協同作用，明顯下調bcl-2和p53的陽性表達，從而使AI升高、PI下降。

［1］Sagowaki C，Jaehne M，Kehrl W，et al.Tumor oxygenenation undercombined whole-body-hyperthermia and polychemotherapy in a case of recurrent carcinoma of the oral cavity［J］.Eur Arch Ororhinolaryngol，2002，259(1):27-30.

［2］徐剛，王遠東.全身熱化療的作用機理［J］.人民軍醫，2002，45(11):637-639.

［3］Rong Y，Mack P.Apoptosis induced by hyperthermia in Dunn osteosarcoma cell line in vitro［J］.Int J Hyperthermia，2000，16(1):19.

［4］Choi EK，Park SR，Lee JH，et al.Induction of apoptosis by carboplatin and hyperthermia alone or combined in WERI human retinoblastoma cells［J］.Int Hyperthermia，2003，19(4):431-443.

［5］蔚伯，谷銑之.腫瘤放射治療學［M］.北京:中國協和醫科大學出版社，2002:437-447.

［6］王琳，楊繼要，吳逸明.熱化療對肺部腫瘤細胞生長影響的研究［J］. 環境與職業醫學，2007，24(2):201-203.

［7］Wang JH，Yao MZ，Zhang ZL，et al.HSF1 blockade-induced tumor thermotolerance abolishment is mediated by JNK-dependent Caspase-3 activation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，321(3):736-745.

［8］高姍，王琳，吳衛東，等.熱化療對肺癌 A549細胞HSP70、JNK及p-JNK蛋白表達的影響［J］.衛生研究，2008，37(5):529-532.

［9］Adell G，Zhang H，Jansson A，et al.Decreased tumor cell proliferation as an indicator of the effect of preoperative radiotherapy of rectal cancer［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，50(3):659-663.