中國漢族人脂聯素基因rs2241766及rs1501299多態性與2型糖尿病及代謝指標的關系

汝穎，葉山東，胡紅琳，陳明衛，王佑民，王長江

(1.安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院內分泌科，合肥230001;2.安徽醫科大學第一附屬醫院內分泌科)

·內分泌疾病專題·

中國漢族人脂聯素基因rs2241766及rs1501299多態性與2型糖尿病及代謝指標的關系

汝穎1，葉山東1，胡紅琳2，陳明衛2，王佑民2，王長江2

(1.安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院內分泌科，合肥230001;2.安徽醫科大學第一附屬醫院內分泌科)

目的 在中國漢族人群中，觀察脂聯素基因rs2241766(T＞G)和rs1501299(G＞T)多態性與2型糖尿病及胰島素抵抗的關系。方法 使用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)銀染技術結合基因直接測序法，對糖耐量正常(NGT)者150例及2型糖尿病(T2DM)患者285例，進行基因的檢測及代謝指標的觀察。結果 rs2241766 TT、TG、GG基因型和rs1501299 GG、GT、TT基因型，在T2DM組及NGT組中的分布存在顯著差異。rs2241766 G(TG+GG)等位基因攜帶者患T2DM的風險增加2倍，而rs1501299 TT攜帶者患T2DM的風險下降;偏相關分析顯示，rs2241766 G(TG+GG)等位基因與HOMAIR呈現正相關，rs1501299 TT基因型與HOMAIR呈現負相關;rs2241766 G攜帶者以及rs1501299 TT攜帶者的體質量指數(BMI)、腰臀部(WHR)、體脂百分比(%body fat)顯著升高。結論 rs2241766 G是中國漢族人 T2DM的危險因素，而rs1501299 TT則是保護因素。

糖尿病，2型;胰島素抵抗;脂聯素;基因;多態現象，遺傳;危險因素;漢族

脂聯素在糖脂代謝的調節中均起重要作用，它能夠促進脂肪酸的氧化以及糖的利用，降低血糖及血脂。因此，脂聯素水平降低或不足能夠導致胰島素抵抗的發生，增加2型糖尿病(T2DM)的風險、惡化代謝相關的臨床指標。脂聯素基因的變異則可能會引起血漿脂聯素水平的改變，進而引起臨床代謝特征以及T2DM患病風險的改變。為此，我們觀察了在中國漢族人中，脂聯素基因的rs2241766(T＞G)和rs1501299(G＞T)單核苷酸多態性與T2DM以及胰島素抵抗的關系。

1 對象和方法

1.1 研究對象 采用2000年1月2001年4月安徽醫科大學第一附屬醫院健康檢查、社區健康檢查以及門診糖尿病篩查者，共435名無親緣關系的安徽地區漢族人，根據1999年WHO診斷標準，分為正常糖耐量(NGT)者150例，年齡34～72(52.7± 8.9)歲，男68例、女82例，體質量指數(BMI)為(25.01±3.07)kg/m2;T2DM患者285例，年齡38～76(53.5±8.7)歲，男 130例、女 155例，BMI (25.66±3.02)kg/m2。排除甲狀腺功能亢進癥、庫欣綜合征以及影響糖代謝的其他系統性疾病。

1.2 方法

1.2.1 臨床指標 隔夜空腹10 h后，口服75 g葡萄糖于0及120 min取靜脈血測定相關指標。以空腹血糖(FPG)及空腹胰島素(FIns)值推算穩態模式胰島素抵抗指數［HOMA-IR=(FPG×FIns)/22.5］及胰島β細胞功能指數［HOMA-β=20×FIns/(FPG -3.5)］，以估測胰島β細胞胰島素分泌功能及外周組織對胰島素的敏感性，體脂百分比(%body fat，男性為1.2×BMI+0.23×年齡-16.2，女性為1.2×BMI+0.23×年齡-5.4)、腰臀比(WHR)、BMI，用于評估體脂含量及分布。

1.2.2 PCR擴增 PCR引物如下:rs2241766正義引物5＇-GGCTCAGGATGCTGTT GC-3’，反義引物5＇-AAGTAGTGTCTGGAGGATGT-3’;rs1501299正義引物5＇-TGAGAAAGGAGATCCAGGTA-3’，反義引物5＇-CACGGCGCTCTTGGTTCTGAA-3’(上海基康公司合成)。PCR反應體系:10×緩沖液5 μl，4×dNTP 1 μl，正反義引物各1 μl，TaqDNA聚合酶2.5 u，DNA模板300 ng，ddH2O補足50 μl。PCR反應條件: 94℃預變性1 min，94℃變性1 min，57℃退火40 s，72℃延伸30 s，31個循環后72℃延伸5 min。

1.2.3 SSCP分析及DNA序列測定 配制6%濃度聚丙烯酰胺凝膠，10 μl PCR產物，加入10 μl甲酰胺變性液和4 μl 6×DNA上樣緩沖液，97℃水浴10 min，冰上驟冷。于4℃，75 V穩壓電泳后，經固定、脫色、銀染、顯影、拍照后，干膠處理。將不同帶型的PCR產物純化后，直接進行基因測序(大連寶生物公司)。

1.3 統計學處理 判讀帶型后，計算各組基因型頻率及等位基因頻率，以Hardy-Weinberg平衡檢驗確認研究樣本的群體代表性。采用SPSS 10.0軟件進行分析，組間頻率比較采用Pearson卡方檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，并進行回歸分析及相關分析。

2 結果

2.1 脂聯素基因rs2241766及rs1501299基因型及等位基因分布 根據SSCP帶型判讀并歸類后，各基因型DNA直接測序如圖1，基因分布如表1。NGT組中rs2241766及rs1501299基因型頻率分別為:TT 59.8%、TG 35.5%、GG 5%以及GG 48.9%，GT 41.8%，TT 9.2%。兩位點在兩組中的基因型分布均達到Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05);兩位點間具有高度的連鎖不平衡(D’=-0.910)。在NGT組及 T2DM組中，rs2241766(P=0.002 and P= 0.001)及rs1501299(P=0.002 and P=0.001)基因型以及等位基因的分布均差異有統計學意義; rs2241766的G等位基因在NGT組的分布頻率高于T2DM組(33.9%vs.22.7%)，rs1501299的T等位基因在NGT組的分布頻率低于T2DM組(22.3% vs.30.1%)(表1)。多因素Logistic回歸分析顯示，rs2241766 GG+TG基因型攜帶者患T2DM的風險較TT型攜帶者增加兩倍(OR=2.068，95%CI 1.368～3.127，P=0.001)，經性別、年齡、BMI校正后差異仍有統計學意義(OR=1.891，95%CI 1.230～2.908，P=0.004);在經性別、年齡、BMI校正后，偏相關分析顯示rs2241766 G等位基因與HOMAIR顯著正相關(r=0.186，P＜0.01)。rs1501299 TT基因型攜帶者患T2DM的風險較GT+GG型攜帶者顯著降低(OR=0.409，95%CI 0.178～0.937，P=0.035)，經校正后OR值為0.442(95%CI 0.188～1.037，P=0.061);偏相關分析顯示TT基因型與與HOMAIR顯著負相關(r=-0.199，P＜0.01)。

2.2 rs2241766及rs1501299與臨床指標的影響T2DM組中，rs2241766不同的基因型攜帶者的2hPG、SBP、FIns、OGTT兩小時胰島素(2hINS)以及HOMAβ(P＞0.05)差異無統計學意義。TG+GG基因型攜帶者BMI、WHR、%body fat、FBG以及HOMAIR，較TT基因型攜帶者顯著升高(P＜0.05 or P＜0.01)，而 DBP具有明顯的升高趨勢(P= 0.055)。在NGT組中，TG+GG基因型攜帶者較TT基因型攜帶者的BMI、WHR、%body fat、FIns、HOMAIR顯著升高(P＜0.05 or P＜0.01)，FBG有升高趨勢(P=0.097)，見表2。

表1 脂聯素基因rs2241766及rs1501299在中國漢族人的分布

表2 T2DM組及NGT組脂聯素基因rs2241766不同基因型攜帶者臨床指標比較(±s)

表2 T2DM組及NGT組脂聯素基因rs2241766不同基因型攜帶者臨床指標比較(±s)

組別 基因型 例數BMI (kg/m2) WHR %body fat FPG (mmol/L) 2hPG (mmol/L) SBP (mmHg) DBP (mmHg) FIns (mIU/L) 2hIns (mIU/L) HOMAIR HOMAβ T2DM 組2 0.309 0.015 0.715 NGT TT 114 24.92±2.86 0.88±0.04 31.33±7.077.81±1.8512.51±4.34 132.17±15.48 82.36±8.75 11.88±7.33 34.24±24.55 1.22±0.60 3.93±0.76 TG+GG 160 25.91±2.98 0.89±0.04 33.41±6.498.35±2.0212.99±4.15 135.18±15.07 84.35±8.13 12.97±8.26 37.07±21.10 1.38±0.50 3.89±0.82 P值 0.006 0.013 0.012 0.026 0.356 0.110 0.055 0.26組TT 84 24.52±3.11 0.87±0.06 31.37±6.644.57±0.43 5.11±1.29 129.20±14.86 80.30±8.20 9.24±3.27 27.59±17.74 0.57±0.32 5.18±0.57 TG+GG 57 25.88±2.76 0.89±0.05 33.82±6.794.70±0.48 5.46±1.16 132.65±13.79 81.96±8.56 11.22±4.24 30.23±20.48 0.78±0.40 5.27±0.55 P值 0.008 0.014 0.035 0.097 0.104 0.166 0.248 0.002 0.416 0.001 0.401

表3 T2DM組及NGT組脂聯素基因rs1501299不同基因型攜帶者臨床指標比較(±s)

表3 T2DM組及NGT組脂聯素基因rs1501299不同基因型攜帶者臨床指標比較(±s)

組別 基因型 例數BMI (kg/m2) WHR %body fat FPG (mmol/L) 2hPG (mmol/L) SBP (mmHg) DBP (mmHg) FIns (mIU/L) 2hINS (mIU/L) HOMAIRHOMAβT2DM 組0 0.582 0.010 0.389 NGT GG+GT 265 26.07±3.00 0.91±0.08 32.90±7.047.30±1.5913.12±4.00 137.34±15.19 82.93±7.07 12.97±7.75 42.90±25.29 1.28±0.54 4.16±0.67 TT 11 23.84±2.55 0.86±0.06 27.62±6.906.12±1.3810.64±3.19 126.55±10.11 80.45±5.22 10.00±5.19 38.64±20.81 0.85±0.55 4.35±0.88 P值 0.016 0.035 0.016 0.016 0.044 0.020 0.253 0.21組GG+GT 128 25.87±2.66 0.86±0.05 31.42±6.464.60±0.49 5.48±1.22 131.31±10.25 79.96±6.93 10.89±5.14 27.81±9.04 0.69±0.46 5.28±0.64 TT 13 22.94±2.36 0.82±0.05 26.54±7.234.35±0.54 4.98±0.95 125.69±10.36 76.38±7.71 6.47±3.17 21.35±5.54 0.08±0.51 5.15±1.23 P值 0.000 0.012 0.011 0.094 0.161 0.620 0.082 0.003 0.013 0.000 0.524

同時，在T2DM組中，rs1501299 TT基因型攜帶者與GT+GG基因型攜帶者相比，其DBP、FIns、2hINS、HOMAβ差異無統計學意義，而 BMI、WHR、%body fat、FIns、2hINS、SBP以及HOMAIR差異有統計學意義;TT基因型攜帶者具有較低的BMI、WHR、%body fat、FBG、2hPG、SBP以及HOMAIR(P＜0.05 or P＜0.01)。

在NGT組中，與GT+GG基因型攜帶者相比，TT基因型攜帶者的BMI、WHR、%body fat、FIns、2hINS、HOMAIR顯著降低(P＜0.05 or P＜0.01)，而且，TT攜帶者的FBG及DBP具有降低趨勢，但差異無統計學意義(0.05＜P＜0.10)，見表3。

3 討論

本研究觀察了脂聯素基因 rs2241766 T/G和rs1501299 G/T對T2DM的發生、以及一些重要的與代謝有關的臨床指標的影響，T2DM患者rs2241766 T/G和rs1501299 G/T基因型以及等位基因分布，與NGT者有顯著不同。rs2241766 G等位基因攜帶者患T2DM的風險增加近2倍，而rs1501299 T等位基因卻是T2DM的一種保護性因素;偏相關分析也提示rs2241766 G等位基因與反映胰島素敏感性的指標HOMA-IR正相關;而rs1501299 T等位基因與HOMA-IR負相關。rs2241766 G等位基因(TG+ GG)攜帶者與野生型攜帶者相比，其BMI、WHR、%body fat、FBG、HOMA-IR以及血壓明顯升高，而rs1501299 TT突變基因型卻顯示出相反的作用。從這些結果可以看出，rs224176 G等位基因以及rs1501299 T等位基因與胰島素敏感性的變化密切相關。另外，多因素 logistic回歸分析顯示，rs2241766 GG+TG基因型、rs1501299 TT基因型攜帶者患T2DM的風險以及與HOMAIR的相關性，經BMI校正后有一定改變，提示BMI也參與了胰島素敏感性的改變，這種現象可能歸因于脂聯素在糖脂代謝中的雙重作用［1］。

不同地區和人群的研究發現，脂聯素基因的單核苷酸多態性與脂聯素的水平、胰島素的敏感性以及T2DM的關系并不一致。與本文結果相似的是，在日本人中的研究發現rs2241766 G等位基因與脂聯素水平的降低以及 T2DM的風險增加密切相關［2］，同樣，在德國人［3］、西班牙人［4］中可見類似的結果。但在法國人［5］、加拿大人［6］以及美國人［7］中，卻發現rs2241766 T等位基因與胰島素抵抗的風險增加相關。rs1501299多態性的研究結果同樣顯示出不一致性，在日本人［2］、西班牙人［4］中的研究結果與本文相一致，G等位基因攜帶者具有胰島素抵抗的臨床特征且患T2DM的風險增加;但在意大利［8］以及加拿大［9］中，rs1501299 T等位基因攜帶者卻與降低的脂聯素水平以及高T2DM患病風險相關。目前這種不同人種中的研究結果不一致的原因尚不明確，但這恰印證了在不同人種中，脂肪細胞因子基因的變異與蛋白濃度以及胰島素抵抗關系不同［10］。

rs2241766 T/G是一種不改變氨基酸序列的同義突變，而rs1501299 G/T位于內含子中，且遠離基因的剪接位點，這兩種單核苷酸多態本身并不能夠改變脂聯素的血漿濃度。有研究已經證實這兩種多態性與rs266729和rs17300539存在連鎖不平衡，后兩者存在于脂聯素基因5’端的啟動區，能夠引起脂聯素基因的表達和血漿中濃度的改變［5］。由于在不同人種中rs2241766和rs1501299等位基因及基因型頻率不同，會導致連鎖不平衡結構發生改變，這可能是不同人種中研究結果不一致的主要原因之一。另外，T2DM是一種高度異質性的多基因疾病，同時又受到環境因素，以及比如吸煙、高脂飲食、缺乏鍛煉等行為的影響［11］;這些因素也會對不同人種中脂聯素基因單核苷酸多態性與T2DM患病風險相關性產生影響。

(本文圖1見封三)

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The association of between the polymorphisms of the adiponectin gene rs2241766 and rs1501299 and the metabolic traits of type 2 diabetes in Han Chinese

RU Ying*，YE Shan-dong，HU Hong-ling，CHEN Ming-wei，WANG You-min，WANG Chang-jiang(*Department of Endocrinology and Metabolism，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001，China)

Objective To investigate the impact of the single nucleotide polymorphisms rs2241766(T＞G) and rs1501299(G＞T)in the adiponectin gene on type 2 diabetes mellitus(T2DM)and insulin resistance in Han Chinese volunteers.Methods Genotypes of 150 subjects with normal glucose tolerance(NGT)and 285 subjects with T2DM，who were Han Chinese residents of the Anhui region，were investigated by using the PCR-SSCP silver staining technique，combined with direct sequencing.Results Significant differences were observed in the frequency distribution of the TT，TG and GG genotypes of rs2241766 and the GG，TG and TT genotypes of rs2241766 between the subjects with T2DM and those with NGT.The G(TG+GG)allele of rs2241766 showed a 2-fold higher risk of T2DM compared with the TT genotype.The TT genotype of rs1501299 showed a lower risk of T2DM compared with the G allele.The partial correlation analysis indicated that the G allele of rs2241766 was positively related to HOMAIR，while the TT genotype of rs1501299 was negatively related to HOMAIR.Carriers of the rs2241766 and rs1501299 risk genotype have some features of insulin resistance.Conclusion The G allele of rs2241766 contribute to the genetic risk of T2DM，but the TT genotype of rs1501299 is a potentially protective factor of T2DM in the Han Chinese population.

Diabetes mellitus，type 2;Insulin resistance;Adiponectin;Genes;Polymorphism，genetic;Risk factors;Han nationality

R587.1

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2012.04.001

2012-02-10)

國家青年自然科學基金(81000321);安徽省高校自然科學基金(KJ2010B385)

汝穎，博士，主治醫師，E-mail:ruying2@gmail.com