反相高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方水楊酸酊中水楊酸和苯甲酸含量

黃 潔，李鋒武，劉鵬鳴，范 菲，單 敏

(陜西省西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710054)

復(fù)方水楊酸酊的主要成分為水楊酸和苯甲酸，臨床上主要用于手足癬、體癬、股癬及花斑癬等的治療。衛(wèi)生部《中國(guó)醫(yī)院制劑規(guī)范(第二版)》(1995年)中采用中和法測(cè)定復(fù)方水楊酸酊的總酸量，但不能分別測(cè)定水楊酸和苯甲酸的含量，故不能有效控制制劑的質(zhì)量。國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[1]中其含量測(cè)定項(xiàng)下水楊酸采用紫外分光光度法，專屬性不強(qiáng);苯甲酸采用容量分析法，操作煩瑣，且消耗樣品和試劑的量大。筆者參考文獻(xiàn)[2－3]，建立了可同時(shí)測(cè)定復(fù)方水楊酸酊中水楊酸和苯甲酸含量的高效液相色譜法，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Ultimate U－3000型高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司);TU－1901型紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)普析通用儀器有限公司)。水楊酸對(duì)照品(批號(hào)為100106－200303)，苯甲酸對(duì)照品(批號(hào)為100419－200301)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;復(fù)方水楊酸酊(西安市中心醫(yī)院自制制劑，批號(hào)為20100406，20100412，20100413);乙腈(色譜純，Merck公司)，四氫呋喃(色譜純，Merck公司)，水為三蒸水(自制)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Phenomenex Luna C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－四氫呋喃－冰醋酸－水(20∶5∶5∶70);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):231 nm;進(jìn)樣量:10 μL。在上述色譜條件下，對(duì)照品及樣品中苯甲酸和水楊酸均能完全分離。色譜圖見圖1。

2.2 溶液配制

取處方中除水楊酸與苯甲酸之外的成分，即乙醇，作為陰性對(duì)照品溶液。精密稱取水楊酸、苯甲酸對(duì)照品適量，用乙醇溶解并稀釋制成分別含水楊酸、苯甲酸 51.6 μg/mL 和 100.1 μg/mL 的對(duì)照品貯備液。精密量取樣品5 mL，置100 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL，置100 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密吸取對(duì)照品貯備液2，4，6，8 mL，置10 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。水楊酸和苯甲酸的線性回歸方程分別為 Y=17 686 564.922 5 X+19 117.430 0(r=0.999 6)和 Y=17920994.0060X+15388.5800(r=0.9999)。結(jié)果表明，水楊酸與苯甲酸質(zhì)量濃度分別在 10.3～51.6μg/mL 和20.0～100.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果水楊酸與苯甲酸的 RSD分別為0.92%和0.60%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品5份，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果水楊酸與苯甲酸的 RSD分別為0.56%和0.95%(n=5)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別配制后于 0，2，4，8，12 h進(jìn)樣，依法測(cè)定。結(jié)果水楊酸和苯甲酸含量的 RSD分別為1.8%和1.1%(n=5)，表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密量取樣品5 mL，置100 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(含水楊酸288.6 μg/mL、苯甲酸547.9 μg/mL)4.0，6.0，8.0 mL，加乙醇稀釋至刻度，搖勻。每個(gè)質(zhì)量濃度分別配制3份溶液，按供試品溶液制備方法處理并測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法分別制備供試品溶液，分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

配制水楊酸和苯甲酸的對(duì)照品溶液，分別于200～400 nm波長(zhǎng)測(cè)定紫外吸收光譜，結(jié)果各待測(cè)物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)水楊酸為303，235，210 nm，苯甲酸為 272，228，202 nm。為了兼顧兩種組分的測(cè)定靈敏度，決定采用231 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

試驗(yàn)中曾采用甲醇－水(40∶60)、0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié) pH 至 5.0)－甲醇(60∶40)、0.4%三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5)－甲醇(45∶55)作為流動(dòng)相，得到的峰形不好且理論板數(shù)差。采用乙腈－四氫呋喃－冰醋酸－水(20∶5∶5∶70)作為流動(dòng)相，得到的峰形好且理論板數(shù)高。

試驗(yàn)過程中使用了美國(guó)Phenomenex C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、大連依利特 YWGC18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)、江蘇漢邦科技 Kromasil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，按擬訂方法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果各組分之間的分離度均大于1.5，表明該方法耐用性良好。試驗(yàn)中將該方法與原標(biāo)準(zhǔn)分析方法比較，結(jié)果近似。由于采用該方法可以同時(shí)測(cè)定水楊酸和苯甲酸的含量，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，故可以作為復(fù)方水楊酸酊中水楊酸和苯甲酸含量的測(cè)定方法。

[1]WS－10001－(HD－1472)－2003，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)·化學(xué)藥品地標(biāo)升國(guó)標(biāo)(第十五冊(cè))[S].

[2]齊臘梅.HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)方苯甲酸酊中的苯甲酸和水楊酸[J].華西藥學(xué)雜志，2008，23(60):716 －717.

[3]楊錫祥，宗 橋，韓 路，等.復(fù)方苯甲酸酊含量測(cè)定方法的改進(jìn)[J].安徽醫(yī)藥，2007，11(9):799 －800.