小細胞肺癌血清細胞因子的表達及其診斷價值

盧先鋒 楊雪琴 楊宇馨 顧咸慶 廖玲 王東

肺癌為最常見的惡性腫瘤，其中小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）占肺癌發(fā)病率的20%。SCLC患者初始治療效果較好，但腫瘤容易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，治療效果并不理想，其總體5年生存率＜5%。目前針對SCLC的血清學(xué)診斷應(yīng)用最廣泛的腫瘤標(biāo)志物包括神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）和胃泌素釋放肽前體（progastrin releasing peptide, ProGrp）等。腫瘤患者免疫防御損傷及免疫功能在疾病的早期已經(jīng)開始發(fā)生變化，已發(fā)現(xiàn)很多細胞因子的表達都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。如：SCLC患者外周血和胸水IL-2水平下降，可能與肺癌的發(fā)生有關(guān)。Alison[1]的研究發(fā)現(xiàn)，吸煙人群血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4和IL-8、IL-7、IL-15水平增高，提示發(fā)生肺癌的可能性大。Yee[2]研究發(fā)現(xiàn)，血清結(jié)締組織活性肽（CTAPIII）聯(lián)合嗜中性細胞激活肽2（NAP-2）可作為臨床前肺癌的檢測指標(biāo)。因此，為了全面系統(tǒng)地研究細胞因子在SCLC患者血清中的變化特點，我們應(yīng)用細胞因子芯片初步檢測了SCLC患者、良性疾病患者與健康人群血清中120種細胞因子，進一步應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA試劑盒）進行驗證，旨在發(fā)現(xiàn)差異表達細胞因子，并探討其在SCLC中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究病例 本研究選擇第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院血清庫2007年-2010年SCLC患者血清197例，其中，男性162例，女性35例，年齡40歲-72歲，中位年齡46歲；其中體重正常組132例，體重明顯下降組65例（體重下降的評估標(biāo)準(zhǔn)為在腫瘤被確診前6個月內(nèi)體重下降≥5%的患者）。正常對照組為正常體檢人員180例，其中男性130例，女性50例，年齡38歲-65歲，中位年齡49歲。良性疾病組為肺炎性疾病患者97例，其中男性55例，女42例，年齡21歲-52歲，中位年齡43歲。所有SCLC病例均有病理組織學(xué)診斷，其中局限期56例，廣泛期141例。入選病例未伴發(fā)感染以及神經(jīng)內(nèi)分泌、高血壓等方面的疾病，無自身免疫異常，無過敏、哮喘等病史。所有血清標(biāo)本均為空腹靜脈采血，離心分離并于-20oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞因子芯片檢測及分析 各組選取4例樣本使用Raybiotech G6/G7細胞因子抗體芯片（芯片包括IL、TGF、TNF、VEGF四個家族共120種細胞因子，購自Raybiotech，美國）進行檢測，其中局限期及廣泛期SCLC各2例均為未接受治療的患者。芯片檢測結(jié)果，每種細胞因子取3個發(fā)光點均值，使用IC歸一化后的數(shù)據(jù)進行Cluster分析。差異蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)：q-value(%)≤5，同時差異倍數(shù)即Fold Change控制在1.5倍以上，樣本數(shù)≥3。Ratio=病變/正常。

1.3 ELISA檢測 人瘦素（Leptin）、巨噬細胞刺激蛋白（macrophage stimulating protein α, MSP-α）、尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（urokinase plasminogen activator receptor,uPAR）、巨噬細胞炎癥蛋白1β（macrophage inflammatory protein 1β, MIP-1β）ELISA檢測試劑盒購自R&D公司（美國），包括預(yù)包被96孔酶標(biāo)板、洗滌緩沖液、終止液、稀釋液、凍干標(biāo)準(zhǔn)品一組、底物緩沖液、ABTS使用液及TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液，ELISA法按照試劑盒操作說明書的步驟進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 細胞因子抗體芯片檢測的原始數(shù)據(jù)進行SAM方差分析后將所有P＜0.05的細胞因子進行Cluster 3.0聚類分析，從而篩選出SCLC組相對于正常對照和炎癥組的差異表達細胞因子。ELISA檢測數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。檢測指標(biāo)敏感度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）；準(zhǔn)確性=（真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）。

表 1 四種差異表達細胞因子組間比較結(jié)果Tab 1 Comparison of expression level of the differential expression cell factors in the different groups

2 結(jié)果

2.1 細胞因子芯片檢測結(jié)果 使用Raybiotech G6/G7120位點細胞因子抗體芯片進行檢測，聚類圖顯示SCLC、炎癥和正常樣本被明顯區(qū)分開（圖1）。在120種細胞因子中，SCLC與正常組的差異表達細胞因子65種，SCLC和炎癥組與正常組的差異表達細胞因子60種，炎癥組與正常組的差異表達細胞因子55種，而SCLC與炎癥組的差異表達細胞因子僅見Leptin。根據(jù)差異表達細胞因子組間比較結(jié)果（表1），我們對Leptin、MSP-α、uPAR、MIP-1β四種細胞因子進行進一步驗證。

圖 1 Raybiotech G6/G7芯片檢測結(jié)果。疾病及兩個對照組血清樣本共12個。首先對樣本蛋白濃度的結(jié)果使用SAM分析方法，然后進行聚類分析。聚類圖顯示SCLC，炎癥和正常樣本明顯分離。Fig 1 The results of Raybiotech G6/G7 Microarrays detection. A total of 12 serum samples were separated into a disease set and two control sets. The results of signaling protein concentrations were analyzed with SAM method initially, and this was followed by cluster analysis.Cluster diagram shows the SCLC, inflammation and normal samples are significantly separated. SCLC: small cell lung cancer.

圖 2 ROC曲線分析結(jié)果。A：uPAR。曲線下面積0.709，P＜0.05，在SCLC組和對照組間有統(tǒng)計學(xué)差異。B：Leptin（normal weight）。曲線下面積0.679，P＜0.05，在SCLC組和對照組間有統(tǒng)計學(xué)差異。C：Leptin（weight lost）。曲線下面積0.577，P=0.053＞0.05，在SCLC組和對照組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。Tab 2 The results of ROC curve analysis. A: uPAR. Area under the curve 0.679, P＜0.05, SCLC group verse control group: statistical significance. B:Leptin (normal weight). Area under the curve 0.679, P＜0.05, SCLC group verse control group: statistical significance. C: Leptin (weight lost). Area under the curve 0.577, P=0.053＞0.05, SCLC group verse control group: no statistical significance.

2.2 ELISA檢測結(jié)果 197例SCLC患者血清uPAR為（2.891,8±1.831,08）ng/L，較健康人群（1.338,1±0.283,79）ng/L以及炎癥患者（1.314,4±0.3053,6）ng/L明顯升高（P＜0.05）。無明顯體重變化的132例SCLC患者血清Leptin為（4.333,1±2.786,69）ng/L，較健康人群（1.819,6±0.436,13）ng/L以及炎癥患者（1.660,4±0.398,03）ng/L明顯升高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而體重下降的65例SCLC患者血清Leptin較對照組無明顯差異。此外，血清MSP-α、MIP-1β水平在三組之間無明顯差異。ROC曲線分析結(jié)果顯示：uPAR在SCLC組和對照組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），Leptin在體重正常的SCLC組和對照組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），Leptin體重下降后的SCLC組和對照組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。血清uPAR診斷SCLC的敏感度及特異度分別為50.11%和86.77%。體重?zé)o明顯變化的SCLC患者血清Leptin診斷SCLC的敏感度及特異度分別為83.36%和52.93%，二者聯(lián)合診斷SCLC的敏感度及特異度分別為50.37%和92.68%（表2）。

3 討論

細胞因子是由淋巴細胞、成纖維細胞、單核巨噬細胞等產(chǎn)生的一種分泌型糖蛋白。細胞因子之間可相互調(diào)節(jié)并形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它們是免疫系統(tǒng)的信息傳遞介質(zhì)，也是神經(jīng)、內(nèi)分泌及其它系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互聯(lián)系的橋梁，在如炎性疾病進展、惡性腫瘤的發(fā)生、進展和復(fù)發(fā)過程中也起著一定的作用[3]。目前，細胞因子在肺癌的研究多針對非小細胞肺癌，而關(guān)于小細胞肺癌尚缺乏系統(tǒng)的研究。此外，傳統(tǒng)的細胞因子檢測方法相對落后，細胞因子抗體芯片技術(shù)應(yīng)用類似酶聯(lián)免疫反應(yīng)的原理，將特異性細胞因子抗體按預(yù)定的陣列形式和順序排列在載體芯片上，將待測的標(biāo)本與之反應(yīng)，對芯片進行掃描，同時計算機軟件對熒光信號進行分析，即可獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。該技術(shù)還具有高通量、高特異度、高靈敏度等特點。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與炎癥密切相關(guān)，而細胞因子IL家族在腫瘤相關(guān)炎癥中具有重要作用，此外還包括MMP家族、TGF家族、TNF家族、VEGF家族。本研究應(yīng)用的Raybiotech G6/G7抗體芯片含有120種細胞因子，包括了IL、TGF、TNF、VEGF家族的多數(shù)蛋白。芯片檢測結(jié)果顯示，疾病（SCLC和炎癥）與正常樣本有明顯差異，聚類分析可以將三者明顯分開，表明SCLC與炎癥及正常對照人群的細胞因子表達譜是存在差異的。應(yīng)用芯片進行篩選我們也證實了許多已報道的小細胞癌相關(guān)細胞因子有統(tǒng)計學(xué)差異，本研究在SCLC組與健康組的比較中，同時表達增高的有56種，包括IL-4、IL-2、TNFβ、TNFα、IGF-I等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的細胞因子。因為炎癥反應(yīng)對機體細胞因子整體水平影響較大，因此需要同時對比SCLC組相對于炎癥組表達增高的指標(biāo)。由于本研究的目的是希望找到SCLC患者血清中較為特異細胞因子，故僅對uPAR、Leptin、MSP-α、MIP-1β進行了進一步的驗證。結(jié)果顯示SCLC患者血清uPAR較健康人群以及炎癥患者增高，Leptin在無體重變化SCLC組較健康人群以及炎癥患者增高，而Leptin在體重下降組較對照組無明顯差異。此外，血清MSP-α、MIP-1β水平在三組之間無明顯差異。

纖溶酶原激活系統(tǒng)與腫瘤的轉(zhuǎn)移侵潤有明顯關(guān)系，腫瘤細胞最初產(chǎn)生無生物活性的uPA酶原與腫瘤細胞表面的特定受體結(jié)合后，被纖溶酶激活，激活的uPA催化纖溶酶原生成纖溶酶，形成正反饋效應(yīng)，破壞細胞外基質(zhì)和細胞基膜，因此，尿激酶型纖溶酶原激活劑和纖溶酶原激活物抑制劑與腫瘤浸潤密切相關(guān)[4]。同時，一些研究[5,6]證實許多腫瘤原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移部位的細胞和其周圍臨近細胞uPA及其受體的表達水平增高。本研究ELISA驗證結(jié)果顯示SCLC患者血清尿激酶型纖溶酶原激活劑受體較健康人群以及炎癥患者明顯升高，進一步證實uPAR可能是診斷SCLC有價值的血清標(biāo)志物。

Leptin具有167個氨基酸序列的16 kDa的蛋白質(zhì)，定位于7號染色體的ob基因，主要為白色脂肪組織產(chǎn)生，胎盤、胃基底細胞以及胰腺可產(chǎn)生少量的Leptin。其ob啟動子可被很多轉(zhuǎn)錄因子所誘導(dǎo)包括HIF-1[7]、過氧化物酶體活性受體激動劑[8]等。研究表明Leptin在子宮內(nèi)膜癌、胃癌等組織中的表達明顯高于癌旁組織，提示Leptin可能具有影響腫瘤細胞分化、增殖的能力[9]，Somasundar[10]進一步證實了Leptin是一種新的促腫瘤生長因子，可刺激腫瘤新生血管的形成，因此在肺癌的發(fā)生和進展中發(fā)揮著重要的作用。Ribeiro等[11]的研究也表明Leptin基因啟動子區(qū)的功能多態(tài)性增加了3倍患非小細胞肺癌的風(fēng)險，其過表達增加了肺癌發(fā)生的可能性。

表 2 檢測的敏感度及特異度分析Tab 2 Analysis of the sensitivity and specificity in detection

Leptin是一種調(diào)節(jié)脂肪含量且增加機體能量消耗的細胞因子，動物實驗證實Leptin具有促進肺組織成熟，加強通氣功能的作用，并證明BMI指數(shù)增高可誘發(fā)小鼠死于腫瘤[12]，同時確定肥胖增加了肺癌的易感性[13,14]。大量的研究表明Leptin在腫瘤引起的體重丟失及腫瘤惡病質(zhì)中可能具有重要作用，但結(jié)果并不一致。Carpagnan等[15]提出在NSCLC患者中血清Leptin水平相對于對照組明顯增高，然而Karapanagiotou等[16]報道了在進展期NSCLC中，血清Leptin水平與患者性別和體重?zé)o關(guān)，其表達程度與肺癌的組織學(xué)類型、分化程度、分期、總生存率以及患者是否發(fā)生惡病質(zhì)無關(guān)，提示Leptin不能作為NSCLC診斷和預(yù)后的參考指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示體重?zé)o變化的SCLC患者在未接受臨床治療前的血清Leptin水平較對照組有明顯差異，而體重下降的患者其Leptin水平與對照組無明顯變化。該結(jié)果提示Leptin水平升高與SCLC患者體重下降沒有明顯關(guān)系，甚至可能是相反的作用，而對體重?zé)o變化的SCLC患者血清Leptin水平升高可能具有一定的診斷價值。

巨噬細胞刺激蛋白-α又稱為肝細胞樣生長因子[17]，可誘導(dǎo)巨噬細胞激活，并促進巨噬細胞趨化作用[18]，同時可抑制巨噬細胞中NO合酶mRNA（信使核糖核酸）的表達[19]等。巨噬細胞炎癥蛋白1β是趨化因子受體CCR1的配體，可由多種細胞產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)其表達水平與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MIP可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移[20,21]，同時MIP通過抑制樹突狀細胞的成熟達到降低其對腫瘤的局部免疫反應(yīng)[22,23]。目前針對MSP-α及MIP-1β在肺癌中的研究較少，大多為探討二者在細胞因子網(wǎng)絡(luò)中與其他細胞因子的相互作用。本文細胞因子芯片檢測結(jié)果顯示，除炎癥組與SCLC組進行組間比較無意義之外，其余各組比較皆有統(tǒng)計學(xué)差異，提示炎癥的發(fā)生對MSP-α及MIP-1β水平影響較大。然而，ELISA檢測并沒有證實其在芯片檢測中相同的結(jié)果，因此，對二者在SCLC中的作用還有待進一步研究。

目前診斷SCLC的敏感血清腫瘤標(biāo)志物包括神經(jīng)元特異性烯醇化酶（敏感度39.73%、特異度89.11%）、胃泌素釋放肽前體（ProGrp）（敏感度51.48%、特異度94.89%）[24]和DKK1（Dickkopf-1, DKK1）[25]等。本組結(jié)果血清uPAR診斷SCLC的敏感度及特異度分別為50.11%和86.77%，體重?zé)o明顯變化的SCLC患者血清Leptin診斷的敏感度及特異度分別為83.36%和52.93%，而二者聯(lián)合診斷的特異度可提高到92.68%，表明uPAR及Leptin聯(lián)合檢測在SCLC診斷中可能更具有臨床價值。