陳皮飲片高效液相指紋圖譜研究＊

封宇飛，張宏武，鄒忠梅，孫春華

(1.衛(wèi)生部北京醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100730;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所，北京100094)

陳皮(Pericarpium Citri Reticulatae)為蕓香科植物橘(Citrus reticulate Blanco)及其栽培變種的干燥的成熟果實(shí)，原名“橘皮”，性溫，味苦、辛，有理氣健脾、燥濕化痰等功效，臨床上用于胸脘脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等癥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，陳皮具有升壓、抗腫瘤、抗炎、抗菌、降血脂、抗過敏和抗哮喘等作用[1－3]。2005年版《中國藥典(一部)》中，采用性狀鑒別的定性手段和單一指標(biāo)成分橙皮苷的定量測定來控制陳皮的質(zhì)量。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)陳皮中的揮發(fā)油、生物堿(如辛弗林)及黃酮類化合物如橙皮苷和川陳皮素等進(jìn)行含量測定[4－8]。雖然這些方法能夠在一定程度上控制陳皮飲片的質(zhì)量，但難于客觀、有效的評(píng)價(jià)或控制藥材的質(zhì)量。而中藥指紋圖譜研究作為現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制和鑒別的新興技術(shù)，為質(zhì)量評(píng)價(jià)問題的解決提供了新的思路和方法。目前，指紋圖譜已成為國際上公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的最有效的手段。美國食品與藥物管理局、英國草藥典、印度草藥、德國藥用植物學(xué)會(huì)、加拿大藥用植物學(xué)會(huì)均接受色譜指紋圖譜的質(zhì)控方法。其優(yōu)點(diǎn)在于可全面反映中藥復(fù)雜的化學(xué)成分及其相對(duì)比例，在大多數(shù)中藥有效成分尚未闡明的現(xiàn)狀下，仍可有效地表征中藥質(zhì)量[9－10]。筆者采用反相高效液相色譜法，建立可反映陳皮飲片全貌的指紋圖譜，為陳皮的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 2690型高效液相色譜儀(996PDA二極管陣列檢測器，515泵，Empower pro工作站);梅特勒AT201型十萬分之一電子天平;RT－02A小型高速粉碎機(jī);Millipore超純水機(jī)，Heidolph LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A，國家藥典委員會(huì))。橙皮苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，含量98.3%);43批陳皮飲片采購于全國22個(gè)省市，中國醫(yī)科院藥用植物研究所林余霖副研究員鑒定確認(rèn)，均為干燥生品(表1);乙腈為色譜純(Fisher，美國)，甲酸為分析純，水為Milli－Q純化系統(tǒng)制備的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.1%甲酸水溶液(A)－乙腈(B)，梯度洗脫(0～20 min，A為 90%;20～35 min，A 為 75% ～90%;35～50 min，A 為 30% ～75%;50～60 min，A為 30% ～90%);檢測波長:300 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4 ℃，進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 溶液制備

精密量取橙皮苷對(duì)照品10.0 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋并定容，作為橙皮苷對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液1 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾后，作為對(duì)照品溶液。稱取陳皮飲片約50.0 g，用粉碎機(jī)粉碎，過篩，精密稱取10.0 g(24～65目)，置250 mL平底燒瓶中，加100 mL水，水浴加熱(60℃)回流提取1 h，放冷，真空過濾，藥渣加入100 mL水同樣操作提取2次，每次1 h，過濾，合并過濾液，減壓濃縮，移至100 mL容量瓶，加水定容，為樣品原液。精密量取原液1 mL，置100 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾后，作為供試品溶液。

2.3 檢測方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 mL，注入液相色譜儀，記錄100 min內(nèi)色譜圖。結(jié)果表明，65 min后無有意義峰出現(xiàn)，故確定圖譜記錄時(shí)間為65 min。對(duì)照品和樣品色譜圖分別見圖1。根據(jù)參照峰的保留時(shí)間和峰面積計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積值。

表1 陳皮樣品來源及相似度計(jì)算結(jié)果

圖1 高效液相色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn):取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，檢測指紋圖譜。計(jì)算各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD值，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間 RSD為0.02% ～0.41%，色譜峰的相對(duì)峰面積的 RSD為0.75% ～1.36%。精密度試驗(yàn)符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一批供試品溶液，按照上述色譜條件，分別于0，6，12，18，24 h檢測指紋圖譜。結(jié)果其共有峰峰面積 RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批陳皮飲片5份，依法制備供試品溶液，并按照上述色譜條件分別檢測指紋圖譜，考察各共有峰相對(duì)峰面積，各供試品溶液的主要共有峰的相對(duì)峰面積 RSD均小于5%。結(jié)果表明，該方法的重現(xiàn)性良好。

2.5 樣品測定結(jié)果

陳皮飲片指紋圖譜測定:對(duì)中藥陳皮飲片進(jìn)行高效液相色譜指紋圖譜測定分析。結(jié)合各地不同飲片的色譜峰狀況，選擇高效液相色譜圖中可以用于反映飲片內(nèi)在質(zhì)量的共有峰，以參照物峰(S)的保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算不同飲片各個(gè)產(chǎn)地的高效液相色譜指紋圖譜的相似性。將各地的陳皮飲片按樣品制備方法制備樣品，并在2.1項(xiàng)色譜條件下檢測HPLC指紋圖譜，根據(jù)不同產(chǎn)地樣品分析的結(jié)果，標(biāo)定共有峰，見圖2。共有峰的峰面積占總峰面積的95%以上，非共有峰的峰面積在總峰面積中所占比例小于5%，所選擇的共有峰可以較全面地反映樣品中化學(xué)成分的信息。

圖2 43批陳皮飲片匹配后指紋圖譜

陳皮飲片的指紋分析圖:應(yīng)用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)各地的陳皮飲片指紋圖譜進(jìn)行譜圖比較，并對(duì)譜圖校正匹配。見圖2。

陳皮飲片的指紋圖譜相似度計(jì)算:應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)”(國家藥典委員會(huì))，對(duì)各地的陳皮飲片指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，以相關(guān)系數(shù)表示相似度。結(jié)果38批陳皮飲片指紋圖譜的相似度在0.85以上，結(jié)果見表1及圖3。陳皮飲片的指紋圖譜相對(duì)峰面積值計(jì)算見表2。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

陳皮飲片所含成分復(fù)雜，且各種類型的化合物極性差別較大，在等度洗脫時(shí)，改變流動(dòng)相的組成或比例只能得到較少的色譜峰，并且洗脫時(shí)間長，色譜峰分離度差。改梯度洗脫，樣品中不同極性組分均獲得了合適保留，在65 min內(nèi)各組分全部出峰。試驗(yàn)過程中選用了多種流動(dòng)相，如甲醇 －0.1%甲酸、甲醇－乙腈 －0.1%甲酸、乙腈－0.1%甲酸的不同梯度洗脫。由于醇－水系統(tǒng)的熱力學(xué)和可壓縮性因素，在梯度洗脫時(shí)易導(dǎo)致基線漂移;且醇－甲酸系統(tǒng)柱壓相對(duì)較高，而乙腈相對(duì)較好，且所得指紋圖譜峰數(shù)較多，故試驗(yàn)選取3號(hào)系統(tǒng)為流動(dòng)相。比較了4個(gè)不同柱溫，發(fā)現(xiàn)隨柱溫上升各色譜峰保留時(shí)間略有提前，但分離度以25℃為佳。故選擇25℃為指紋圖譜檢測柱溫。

圖3 全國不同省市的43批市售樣品的相似度分布

表2 43批樣品飲片指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積值

3.2 波長選擇

結(jié)果表明，波長300 nm檢測時(shí)，其高效液相圖譜中可觀察到較多的色譜峰，同時(shí)各色譜峰分離較好，并且在此波長處各色譜峰的吸收均較強(qiáng)，故確定300 nm為檢測波長。

3.3 提取方式選擇

4種提取方法的提取效果可從高效液相色譜圖中看出，以甲醇作為溶劑所得到的提取液，其橙皮苷的含量很高，即橙皮苷提取率很高，而從峰個(gè)數(shù)上看，其峰數(shù)很少;水回流提取液的效果卻恰恰相反。加熱回流較超聲提取率要高。并且，傳統(tǒng)陳皮飲片采用水煎(水提)，因此，筆者采用水加熱回流提取作為最佳提取方法。研究中還發(fā)現(xiàn)，橙皮苷、柚皮蕓香苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'－七甲氧基黃酮及紅橘素不易溶于冷水，較溶于熱水中。為了減少這現(xiàn)象給試驗(yàn)帶來的影響，水提物應(yīng)趁熱濾過。

3.4 對(duì)照品選擇

陳皮中含有黃酮類化合物、揮發(fā)油及生物堿等，各類成分均能在一定程度上代表陳皮的某些藥理活性，其中，橙皮苷為其主要活性成分之一，同時(shí)，筆者研究發(fā)現(xiàn)該成分在陳皮飲片中含量最高。因此，選擇橙皮苷作為對(duì)照品。

3.5 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

采用高效液相色譜法對(duì)陳皮飲片的指紋圖譜進(jìn)行了研究，各樣品圖譜雖存在一定差異，但均具有相同的色譜特征峰。該方法一次進(jìn)樣即能得到眾多的色譜峰，分離分析效率高，且各色譜峰保留時(shí)間相當(dāng)穩(wěn)定，所建立的指紋圖譜具有穩(wěn)定性和可控性。

分析了全國不同省市市售43批陳皮飲片指紋圖譜，共有11個(gè)特征峰，各色譜峰的保留時(shí)間匹配總體較好，保留時(shí)間 RSD均小于5%。但因樣品的個(gè)體差異，特征峰的相對(duì)含量分布差異較大。樣品編號(hào)為 8，16，19，21，23 的相似度在 0.576 ～0.787 之間，質(zhì)量與其他大多數(shù)樣品存在較大差異，建議將相似度0.85作為判定陳皮飲片合格與否的限度。結(jié)果表明，全國各地的市售陳皮飲片質(zhì)量不統(tǒng)一，這更迫切的要求我們建立可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來控制藥材的質(zhì)量，同時(shí)也說明相似度與藥材銷售地相關(guān)。

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