索曼染毒對大鼠腦組織乙酰膽堿受體m1和m4 mRNA表達的影響

康健捷 劉 雁 徐海偉 (廣州軍區廣州總醫院神經內科，廣東 廣州 5000)

索曼(O-1，2，2-trime thylpropy1 methylphosphonofluoridate)屬有機磷酸酯類化合物，與對硫磷、乙拌磷等農用殺蟲劑有相似的化學結構，長期接觸小劑量有機磷化合物可導致人學習記憶認知功能下降，索曼揮發度適中，易于分散，可通過皮膚和呼吸道雙途徑吸收引起全身中毒〔1〕。作為強烈的膽堿酯酶(AChE)抑制劑，大劑量急性染毒時，索曼通過迅速不可逆地抑制神經突觸中的AChE引起乙酰膽堿(Ach)大量堆積，從而導致中樞和外周膽堿能神經過度刺激而產生臨床癥狀〔2，3〕。慢性小劑量索曼染毒可在無明顯軀體膽堿能過度刺激癥狀的情況下導致腦損害，出現學習記憶能力下降〔4〕，在中樞神經系統中，突觸后膜Ach受體m1在學習記憶等認知功能和海馬及皮層的長時程增強(LTP)過程中起重要作用〔5〕，神經末梢的突觸前膜Ach受體m4對Ach的釋放進行負反饋調節。本實驗采用RT-PCR方法，觀察小劑量索曼染毒對大鼠海馬及前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組與模型建立 雄性健康Wistar大鼠，24只，體質量(180±30)g，由第三軍醫大學實驗動物所提供。隨機分為生理鹽水對照組、半數致死量對照組、6 μg/kg染毒組和10 μg/kg染毒組，每組 6 只。6 μg/kg染毒組和 10 μg/kg染毒組每天上午背部皮下注射一次索曼，劑量分別分6 μg/kg(相當于 0.06 LD50)和 10 μg/kg(相當于 0.1 LD50)，共 14 d。生理鹽水對照組每天注射相同體積的生理鹽水。末次給藥后第2天，取大鼠腦組織用于檢測Ach受體m1和m4 mRNA表達水平;半數致死量對照組大鼠取樣前注射一次索曼，劑量分100 μg/kg(相當于 LD50)。

1.2 RT-PCR檢測小劑量索曼染毒對大鼠腦組織Ach受體m1和m4 mRNA表達的影響 實驗所需試劑及器材預先經過焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理。末次給藥第2天上午將大鼠斷頭處死，于冰臺上分離出海馬和前額葉皮層各10 mg，取同組6例共60 mg，加入1 ml Tripure，用玻璃勻漿器充分勻漿;提取總RNA、檢測RNA濃度和純度、逆轉錄酶反應、多聚酶鏈反應。引物設計:從 GenBenk(http://www.ncbi.nih.gov/entrez/nucleoyide.htlm)中調取大鼠Ach受體m1、m4和甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)完整 cDNA序列，以此為參照，通過網站(www.genome.wi.mit.edu)提供的引物設計程序，設計出PCR引物序列。通過同源性比較(http://www.ncbi.nih.gov/blast)均為特異引物，送上海Bioasia公司合成。根據擴增條帶的位置和熒光強度，判斷擴增產物大小。將處理組與對照組比較，觀察熒光強度的OD值，增強為表達上調，反之為下調。實驗結果重復3次以上。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.0統計軟件進行分析，采用單因素方差檢驗，計量資料均以±s表示。

2 結果

在14 d給藥期間生理鹽水對照組、6 μg/kg染毒組、10 μg/kg染毒組大鼠均未發現有驚厥、死亡現象，10 μg/kg染毒組有輕微腹瀉現象。半數致死量對照組(100 μg/kg)大鼠均出現驚厥，其中2只死亡。

半數致死量對照組(100 μg/kg組)大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA表達均與生理鹽水對照組無顯著差別。小劑量染毒組(6 μg/kg組和10 μg/kg組)大鼠前額葉皮層Ach受體m1 mRNA表達均顯著低于生理鹽水對照組，差異有統計學意義(P＜0.05);海馬Ach受體m1 mRNA表達略低于生理鹽水對照組，但組間無差異(P＞0.05)，前額葉皮層和海馬Ach受體m4 mRNA表達均顯著高于生理鹽水對照組(P＜0.05)，其中10 μg/kg組大鼠前額葉皮層 Ach受體 m4 mRNA表達與生理鹽水對照組相比差異顯著(P＜0.01)。在生理鹽水對照組和半數致死量對照組間Ach受體m1 mRNA和m4 mRNA均無顯著差別(P＞0.05)。見表1，圖1，圖2。

表1 索曼染毒大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA的變化(OD乙酰膽堿受體m1(乙酰膽堿受體m4)/ODGAPDH)(±s)

表1 索曼染毒大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA的變化(OD乙酰膽堿受體m1(乙酰膽堿受體m4)/ODGAPDH)(±s)

與生理鹽水對照組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.01，與半數致死量對照組比較:3)P＜0.05

±0.046組別 n 乙酰膽堿受體m1海馬 前額葉皮層乙酰膽堿受體m4海馬±0.025 6 μg/kg染毒組 6 0.275±0.022 0.250±0.0161)3) 0.627±0.0301)3) 0.364±0.0311)3)10 μg/kg染毒組 6 0.270±0.019 0.247±0.0181)3) 0.671±0.0741) 0.426±0.0662)半數致死量對照組 4 0.289±0.029 0.277±0.028 0.531±0.054 0.271前額葉皮層生理鹽水對照組 6 0.294±0.027 0.287±0.021 0.528±0.031 0.274

圖1 各組大鼠海馬(左圖)和前額葉皮層(右圖)Ach受體m1 mRNA的表達(上:m1，下:GAPDH)

圖2 各組大鼠海馬(左圖)和前額葉皮層(右圖)Ach受體m4 mRNA的表達(上:m4，下:GAPDH)

3 討論

親酯性索曼可迅速穿過血腦屏障進入腦組織，在體內的水解非常緩慢，特別是在腦和肌肉中〔6〕。索曼持續不可逆地抑制AchE，并使之老化，導致Ach降解減弱，造成腦組織Ach大量堆積。既往的研究采用Morris水迷宮檢測大鼠的空間學習記憶能力，結果顯示慢性小劑量索曼染毒可抑制大鼠學習記憶的獲得與鞏固過程，降低已儲存記憶的讀出或提取能力〔4〕。現有理論認為:腦內膽堿能受體的增減受Ach含量的調控，Ach含量高則膽堿能受體數量下降，反之則升高。AchE能迅速催化Ach的水解，是Ach水解的主要方式，AchE活性的變化可直接反映Ach的代謝情況，從而在一定程度上體現膽堿能系統的功能狀況。因此，研究有機磷中毒對膽堿能系統的影響時，常選用測定AchE的活性來反映膽堿水平。以往的研究證實:大鼠連續14 d皮下注射小劑量索曼，其海馬和前額葉皮層的AchE活性明顯下降，對Ach的降解作用減弱，造成與認知記憶功能密切相關腦區Ach大量堆積〔4〕。

Ach受體M受體亞型m1和m4的mRNA和蛋白在海馬和額葉皮層均有較高表達。本實驗觀察到慢性小劑量索曼染毒大鼠前額葉皮層Ach受體m1 mRNA表達與生理鹽水對照組相比明顯降低。推測大量堆積的Ach長期過度刺激突觸后膜的Ach受體，導致Ach受體m1在基因水平轉錄減少，從而可能導致Ach受體蛋白水平下降。而膽堿能系統與認知記憶功能密切相關，尤其是海馬和前額葉皮層，研究證實突觸后膜Ach受體m1下降，膽堿能系統功能下降，可導致認知功能障礙，并抑制海馬及皮層的LTP〔7〕。以往的研究顯示慢性小劑量索曼染毒可降低海馬LTP誘出率，降低群峰電位(PS)增加幅值〔8〕，提示索曼可降低海馬突觸可塑性。因此，索曼可能從基因水平下調Ach受體m1，降低海馬突觸可塑性和膽堿能系統功能，從而導致大鼠學習記憶能力降低。

在中樞神經系統中，Ach受體m4在突觸前膜，當突觸間隙Ach增高時，m4受體則上調，以減少Ach的釋放。所以，突觸前膜Ach受體m4對Ach釋放起到負反饋調節作用。既往研究表明Ach受體m4上調與學習記憶障礙有密切關系〔5〕。本研究結果顯示:兩組小劑量染毒大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m4 mRNA表達均明顯增加，且在AchE抑制率和Ach受體m4 mRNA表達增加程度上表現一致，即較大劑量的索曼較高程度地抑制AchE活力，導致Ach受體m4亞型在轉錄水平表達加強程度更高。而半數致死量對照組大鼠Ach受體m4 mRNA表達均與生理鹽水對照組無顯著差別，提示小劑量染毒組大鼠腦組織Ach受體m4 mRNA表達增加是索曼慢性作用的結果，而Ach受體m4 mRNA表達增加必導致對Ach的負反饋調節作用增強，逐漸降低突觸前膜對Ach的釋放，從而導致神經中樞膽堿能系統功能下降。

基于以上闡述，慢性小劑量索曼染毒可導致突觸后膜Ach受體m1從基因水平下調，而突觸前膜Ach受體m4從基因水平上調，以加強對Ach釋放的負反饋調節作用，從而導致神經中樞膽堿能系統功能下降，這可能是大鼠學習記憶能力下降的結構基礎。但有關索曼染毒致認知功能障礙的實驗研究，還需要從與認知功能有關的M受體亞型的蛋白水平及其他膽堿受體亞型基因水平等方面進一步證實。

1 Niven AS，Roop SA.Inhalational exposure to nerve agents〔J〕.Respir Care Clin N Am，2004;10(1):59-74.

2 Stone DJ，Terry AV，Jr Pauly JR，et al.Protractive effects of chronic treatment with an acutely sub-toxic regimen of diisopropylflurophosphate on the expression of cholinergic receptor densities in rats〔J〕.Brain Res，2000;882(1-2):9-18.

3 Bide RW，Schofield L，Risk DJ.Immediate post-dosing paralysis following severe soman and VX toxicosis in guinea pigs〔J〕.J Appl Toxicol，2005;25(5):410-7.

4 康健捷，黎海蒂，徐海偉.慢性低劑量梭曼染毒對大鼠學習記憶及腦組織膽堿酯酶活力的影響〔J〕.中國行為醫學科學，2004;13(4):370-1.

5 Baille V，Dorendeu F，Carpentier P，et al.Acute exposure to a low or mild dose of soman:Biochemical，behavioral and histopathological effects〔J〕.Pharmacol，Biochem Behav，2001;69(2):561-9.

6 Li JT，Ruan JX，Zhang ZQ，et al.Effects of pretreatment with verapamil on the toxicokinetics of soman in rabbits and distribution in mouse brain and diaphragm〔J〕.Toxicol Lett，2003;138(3):227-33.

7 Armstrong DL，Osaka T，Murphy MR，et al.Blockade of hippocampal long-term potentiation following soman pretreatment in the rat〔J〕.Brain Res Bull，1997;43(1):117-20.

8 康健捷，黎海蒂，徐海偉，等，小劑量梭曼對大鼠學習記憶和海馬腦片LTP的影響〔J〕.第三軍醫大學學報，2003;25(3):230-2.