索曼染毒對(duì)大鼠腦組織乙酰膽堿受體m1和m4 mRNA表達(dá)的影響

康健捷 劉 雁 徐海偉 (廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 5000)

索曼(O-1，2，2-trime thylpropy1 methylphosphonofluoridate)屬有機(jī)磷酸酯類化合物，與對(duì)硫磷、乙拌磷等農(nóng)用殺蟲劑有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，長期接觸小劑量有機(jī)磷化合物可導(dǎo)致人學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能下降，索曼揮發(fā)度適中，易于分散，可通過皮膚和呼吸道雙途徑吸收引起全身中毒〔1〕。作為強(qiáng)烈的膽堿酯酶(AChE)抑制劑，大劑量急性染毒時(shí)，索曼通過迅速不可逆地抑制神經(jīng)突觸中的AChE引起乙酰膽堿(Ach)大量堆積，從而導(dǎo)致中樞和外周膽堿能神經(jīng)過度刺激而產(chǎn)生臨床癥狀〔2，3〕。慢性小劑量索曼染毒可在無明顯軀體膽堿能過度刺激癥狀的情況下導(dǎo)致腦損害，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降〔4〕，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，突觸后膜Ach受體m1在學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能和海馬及皮層的長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)過程中起重要作用〔5〕，神經(jīng)末梢的突觸前膜Ach受體m4對(duì)Ach的釋放進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法，觀察小劑量索曼染毒對(duì)大鼠海馬及前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型建立 雄性健康Wistar大鼠，24只，體質(zhì)量(180±30)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所提供。隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、半數(shù)致死量對(duì)照組、6 μg/kg染毒組和10 μg/kg染毒組，每組 6 只。6 μg/kg染毒組和 10 μg/kg染毒組每天上午背部皮下注射一次索曼，劑量分別分6 μg/kg(相當(dāng)于 0.06 LD50)和 10 μg/kg(相當(dāng)于 0.1 LD50)，共 14 d。生理鹽水對(duì)照組每天注射相同體積的生理鹽水。末次給藥后第2天，取大鼠腦組織用于檢測Ach受體m1和m4 mRNA表達(dá)水平;半數(shù)致死量對(duì)照組大鼠取樣前注射一次索曼，劑量分100 μg/kg(相當(dāng)于 LD50)。

1.2 RT-PCR檢測小劑量索曼染毒對(duì)大鼠腦組織Ach受體m1和m4 mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)所需試劑及器材預(yù)先經(jīng)過焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理。末次給藥第2天上午將大鼠斷頭處死，于冰臺(tái)上分離出海馬和前額葉皮層各10 mg，取同組6例共60 mg，加入1 ml Tripure，用玻璃勻漿器充分勻漿;提取總RNA、檢測RNA濃度和純度、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)、多聚酶鏈反應(yīng)。引物設(shè)計(jì):從 GenBenk(http://www.ncbi.nih.gov/entrez/nucleoyide.htlm)中調(diào)取大鼠Ach受體m1、m4和甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)完整 cDNA序列，以此為參照，通過網(wǎng)站(www.genome.wi.mit.edu)提供的引物設(shè)計(jì)程序，設(shè)計(jì)出PCR引物序列。通過同源性比較(http://www.ncbi.nih.gov/blast)均為特異引物，送上海Bioasia公司合成。根據(jù)擴(kuò)增條帶的位置和熒光強(qiáng)度，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物大小。將處理組與對(duì)照組比較，觀察熒光強(qiáng)度的OD值，增強(qiáng)為表達(dá)上調(diào)，反之為下調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次以上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差檢驗(yàn)，計(jì)量資料均以±s表示。

2 結(jié)果

在14 d給藥期間生理鹽水對(duì)照組、6 μg/kg染毒組、10 μg/kg染毒組大鼠均未發(fā)現(xiàn)有驚厥、死亡現(xiàn)象，10 μg/kg染毒組有輕微腹瀉現(xiàn)象。半數(shù)致死量對(duì)照組(100 μg/kg)大鼠均出現(xiàn)驚厥，其中2只死亡。

半數(shù)致死量對(duì)照組(100 μg/kg組)大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA表達(dá)均與生理鹽水對(duì)照組無顯著差別。小劑量染毒組(6 μg/kg組和10 μg/kg組)大鼠前額葉皮層Ach受體m1 mRNA表達(dá)均顯著低于生理鹽水對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);海馬Ach受體m1 mRNA表達(dá)略低于生理鹽水對(duì)照組，但組間無差異(P＞0.05)，前額葉皮層和海馬Ach受體m4 mRNA表達(dá)均顯著高于生理鹽水對(duì)照組(P＜0.05)，其中10 μg/kg組大鼠前額葉皮層 Ach受體 m4 mRNA表達(dá)與生理鹽水對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)。在生理鹽水對(duì)照組和半數(shù)致死量對(duì)照組間Ach受體m1 mRNA和m4 mRNA均無顯著差別(P＞0.05)。見表1，圖1，圖2。

表1 索曼染毒大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA的變化(OD乙酰膽堿受體m1(乙酰膽堿受體m4)/ODGAPDH)(±s)

表1 索曼染毒大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA的變化(OD乙酰膽堿受體m1(乙酰膽堿受體m4)/ODGAPDH)(±s)

與生理鹽水對(duì)照組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.01，與半數(shù)致死量對(duì)照組比較:3)P＜0.05

±0.046組別 n 乙酰膽堿受體m1海馬 前額葉皮層乙酰膽堿受體m4海馬±0.025 6 μg/kg染毒組 6 0.275±0.022 0.250±0.0161)3) 0.627±0.0301)3) 0.364±0.0311)3)10 μg/kg染毒組 6 0.270±0.019 0.247±0.0181)3) 0.671±0.0741) 0.426±0.0662)半數(shù)致死量對(duì)照組 4 0.289±0.029 0.277±0.028 0.531±0.054 0.271前額葉皮層生理鹽水對(duì)照組 6 0.294±0.027 0.287±0.021 0.528±0.031 0.274

圖1 各組大鼠海馬(左圖)和前額葉皮層(右圖)Ach受體m1 mRNA的表達(dá)(上:m1，下:GAPDH)

圖2 各組大鼠海馬(左圖)和前額葉皮層(右圖)Ach受體m4 mRNA的表達(dá)(上:m4，下:GAPDH)

3 討論

親酯性索曼可迅速穿過血腦屏障進(jìn)入腦組織，在體內(nèi)的水解非常緩慢，特別是在腦和肌肉中〔6〕。索曼持續(xù)不可逆地抑制AchE，并使之老化，導(dǎo)致Ach降解減弱，造成腦組織Ach大量堆積。既往的研究采用Morris水迷宮檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示慢性小劑量索曼染毒可抑制大鼠學(xué)習(xí)記憶的獲得與鞏固過程，降低已儲(chǔ)存記憶的讀出或提取能力〔4〕。現(xiàn)有理論認(rèn)為:腦內(nèi)膽堿能受體的增減受Ach含量的調(diào)控，Ach含量高則膽堿能受體數(shù)量下降，反之則升高。AchE能迅速催化Ach的水解，是Ach水解的主要方式，AchE活性的變化可直接反映Ach的代謝情況，從而在一定程度上體現(xiàn)膽堿能系統(tǒng)的功能狀況。因此，研究有機(jī)磷中毒對(duì)膽堿能系統(tǒng)的影響時(shí)，常選用測定AchE的活性來反映膽堿水平。以往的研究證實(shí):大鼠連續(xù)14 d皮下注射小劑量索曼，其海馬和前額葉皮層的AchE活性明顯下降，對(duì)Ach的降解作用減弱，造成與認(rèn)知記憶功能密切相關(guān)腦區(qū)Ach大量堆積〔4〕。

Ach受體M受體亞型m1和m4的mRNA和蛋白在海馬和額葉皮層均有較高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)觀察到慢性小劑量索曼染毒大鼠前額葉皮層Ach受體m1 mRNA表達(dá)與生理鹽水對(duì)照組相比明顯降低。推測大量堆積的Ach長期過度刺激突觸后膜的Ach受體，導(dǎo)致Ach受體m1在基因水平轉(zhuǎn)錄減少，從而可能導(dǎo)致Ach受體蛋白水平下降。而膽堿能系統(tǒng)與認(rèn)知記憶功能密切相關(guān)，尤其是海馬和前額葉皮層，研究證實(shí)突觸后膜Ach受體m1下降，膽堿能系統(tǒng)功能下降，可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，并抑制海馬及皮層的LTP〔7〕。以往的研究顯示慢性小劑量索曼染毒可降低海馬LTP誘出率，降低群峰電位(PS)增加幅值〔8〕，提示索曼可降低海馬突觸可塑性。因此，索曼可能從基因水平下調(diào)Ach受體m1，降低海馬突觸可塑性和膽堿能系統(tǒng)功能，從而導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Ach受體m4在突觸前膜，當(dāng)突觸間隙Ach增高時(shí)，m4受體則上調(diào)，以減少Ach的釋放。所以，突觸前膜Ach受體m4對(duì)Ach釋放起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。既往研究表明Ach受體m4上調(diào)與學(xué)習(xí)記憶障礙有密切關(guān)系〔5〕。本研究結(jié)果顯示:兩組小劑量染毒大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m4 mRNA表達(dá)均明顯增加，且在AchE抑制率和Ach受體m4 mRNA表達(dá)增加程度上表現(xiàn)一致，即較大劑量的索曼較高程度地抑制AchE活力，導(dǎo)致Ach受體m4亞型在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)加強(qiáng)程度更高。而半數(shù)致死量對(duì)照組大鼠Ach受體m4 mRNA表達(dá)均與生理鹽水對(duì)照組無顯著差別，提示小劑量染毒組大鼠腦組織Ach受體m4 mRNA表達(dá)增加是索曼慢性作用的結(jié)果，而Ach受體m4 mRNA表達(dá)增加必導(dǎo)致對(duì)Ach的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)，逐漸降低突觸前膜對(duì)Ach的釋放，從而導(dǎo)致神經(jīng)中樞膽堿能系統(tǒng)功能下降。

基于以上闡述，慢性小劑量索曼染毒可導(dǎo)致突觸后膜Ach受體m1從基因水平下調(diào)，而突觸前膜Ach受體m4從基因水平上調(diào)，以加強(qiáng)對(duì)Ach釋放的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致神經(jīng)中樞膽堿能系統(tǒng)功能下降，這可能是大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但有關(guān)索曼染毒致認(rèn)知功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究，還需要從與認(rèn)知功能有關(guān)的M受體亞型的蛋白水平及其他膽堿受體亞型基因水平等方面進(jìn)一步證實(shí)。

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