長效多肽藥物化學修飾的研究進展

姜 和，龔夢嘉

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院，重慶 400054;2.重慶前沿生物技術公司，重慶 400041)

多肽類藥物作為近年來研究的熱點，受到國內外制藥界的廣泛關注，在癌癥、艾滋病［1］等重大疾病的治療中顯示出巨大的應用價值。

多肽類藥物雖然安全、生物活性好，但多數因半衰期較短而需頻繁給藥，這使病人的依從性大大降低，并且治療費用也較大，因此，為了保持藥效的持久、不用頻繁給藥，對于長效多肽類藥物的研發近年來成為了多肽藥物領域的研究熱點。多肽類藥物的長效化技術主要有體外化學修飾技術、生物技術和緩控釋制劑技術［2］。體外化學修飾技術是在多肽水平上，使用合適的修飾方法和修飾劑對其進行化學修飾［3］，使修飾后的多肽類藥物在體內的半衰期延長。該技術主要包括主鏈末端的修飾［4］、側鏈的修飾［5］、環化［6］、氨基酸替換［7］、糖基化修飾［8］及 PEG 修飾［9］等。

1 主鏈末端的修飾

多肽類藥物常用的主鏈末端修飾方法是N端的乙?；饔煤虲端的酰胺化作用［10］，分別對肽鏈兩端氨基和羧基進行保護，使多肽不會很快地被相應的多肽蛋白酶降解。目前這一技術已經廣泛應用于多肽的化學合成中。N端乙?；ǔＪ窃诠滔嗪铣啥嚯姆磻恼麄€肽鏈組合完畢后，加入乙酸酐使其乙?；?。C端的酰胺化則是通過選擇裂解產物為酰胺的樹脂或者選擇不同裂解方式來完成。Brinckerhoff等［11］通過對具有免疫原性的多肽MART-I27-35進行N端的乙酰化或者C端的酰胺化，明顯提高了該多肽在血漿中的穩定性。

主鏈末端連接不同長度的脂肪酸、主鏈C端或N端的PEG修飾及糖基化修飾，其基本原理都是增加多肽分子的相對分子量和空間位阻，提高其對多肽水解酶的穩定性，減少腎小球的濾過作用。RC-160是一種具有抗增生活性的生長激素抑制劑類似物。Dasgupta等［12］將各種長度的脂肪酸連接在RC-160的主鏈末端。與未修飾的RC-160相比較，修飾后的RC-160對于胰島素有更高的抵抗能力和更長的半衰期。

2 側鏈的修飾

多肽側鏈基團的化學修飾是通過選擇性試劑(也稱修飾劑)與多肽側鏈上特定的功能基團發生化學反應而實現，從而改變多肽的化學性質，如消除免疫原性和免疫反應性、延長了多肽藥物在體內的作用時間等［13－14］。David Sabatino 等［15］在對生長激素釋放多肽(growth hormone releasing peptide，GHRP-6)類似物的合成研究中，通過對Trp2、Ala3、Trp4的化學修飾，在側鏈上連接不同的基團(如圖1所示)，從而形成氮雜多肽(aza-peptide)。在考察經修飾的各種氮雜多肽的IC50時，發現其中一種結構為His-D-Trp-Ala-azaPhe-D-Phe-Lys-NH2的氮雜多肽與受體的結合率是未經修飾的GHRP-6的1000倍。

圖1 GHRP-6及其類似物結構式

正交保護氨基酸在固相多肽合成中的應用對多肽的側鏈修飾起著重要的作用。正交保護是指在一定條件下，分子中的一組保護基可以被選擇性地脫除，而其他保護基不受影響，進而達到可選擇性修飾的目的［16］。謝東等［17］在合成的長效HIV融合抑制劑艾博衛泰中，對第13位的賴氨酸(Lys)采用 Alloc保護的Fmoc-Lys(Alloc)-OH，用特定的條件選擇性地脫除保護基Alloc，而另一氨基保護基Fmoc和肽鏈上其他氨基酸的側鏈保護基均不受影響，再用Fmoc-AEEA(Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸)和MIPA(3-馬來酰亞胺基丙酸)對Lys13進行修飾，使肽鏈進入血液后能夠迅速與白蛋白結合，從而發揮長效的作用。經臨床實驗驗證，艾博衛泰的半衰期可長達2周。

對肽鏈中某一個氨基酸進行定點修飾是側鏈修飾的一項前沿的、重要的技術，也是實現側鏈修飾可控的保證。Peng Wu等［18］報道了重組蛋白在哺乳動物細胞中表達，通過基因編碼乙醛標記可對重組蛋白中的某些特定位點進行特異性的乙醛標記，這些乙醛標記既可作為定點修飾的位點，也可用于進一步的化學修飾。這項技術已應用在對單克隆抗體、多肽類藥物等的定點修飾中。

3 環化

在多數情況下，機體內的氨肽酶及羧肽酶很容易從常見的直鏈肽的兩端進行逐步的切割分解，使直鏈肽被降解，因此，對肽鏈進行環化結構改造，可以提高多肽類藥物在機體內的生物穩定性，延長半衰期［19］。按照橋頭環化位置可將環肽分為5類:C端與N端相連、側鏈間相連、N端與側鏈相連、C端與側鏈相連以及主鏈上的N-N相連［20］，如圖2 所示。

圖2 按照橋頭環化位置的環肽分類

生長調節因子(growth regulating factor，GRF)是由29個氨基酸組成的多肽，肽序為YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLL QDIMSR。該多肽在37℃的豬血漿中的半衰期只有15 min。研究人員選取不同位點進行環化處理，得到不同的衍生物，實驗結果如表1所示，其半衰期明顯提高到4 h以上［21］。

表1 環化修飾后GRF類似物在豬血漿中的穩定性

Annett Rozek等［22］報道了一吲哚類多肽類似物 CP-11，結構為 ILKKWPWWPWR RK-NH2，通過二硫鍵進行成環修飾，得到cycloCP-11，在胰島素共同存在和作用下，可以使胰島素的半衰期由4 min提高到 18 min。LEDGF(lens epithelium-derived growth factor)/p75是 HIV-1整合酶。Zvi等［23］通過對LEDGF/p75結構和功能的研究，取該蛋白質中的一段肽鏈，合成HIV-1整合酶抑制劑LEDPG 361-370，合成過程中應用Alloc保護的氨基酸，并進行特異性保護基的脫除，實現直鏈肽的首尾成環(圖3)。LEDPG 361-370半衰期可長達8 d。

圖3 LEDPG 361-370結構

4 氨基酸替換

替換肽鏈中的某幾個氨基酸是另一種推遲酶降解使多肽藥物的半衰期延長的方式，替換對象通常為肽鏈中的易酶解的氨基酸。

將L型氨基酸替換為D型非天然氨基酸是氨基酸替換的一種常規方法。西曲瑞克(cetrorelix)是一種促黃體激素釋放激素(luteinizing hormone releasing hormone，LHRH)拮抗劑，用于治療子宮纖維瘤、子宮內膜異位、卵巢癌以及改善良性前列腺肥大。西曲瑞克是將LHRH中的幾個氨基酸替換為非天然的D型氨基酸，結構對比如圖4所示［24］。西曲瑞克在多種酶存在的情況下半衰期可長達50 h，而LHRH的半衰期只有幾小時［25］。從西曲瑞克的用法和劑量也可以看出其長效性:單劑量給藥0.25 mg，作用可持續24 h;一次注射3 mg，藥效可維持4 d。

圖4 LHRH與西曲瑞克結構比較

Strausberg等［26］對枯草桿菌蛋白酶中隨機的一段12個氨基酸組成的多肽鏈進行氨基酸替換，以對溫度的穩定性和催化活性為基礎進行篩選。篩選結果表明，在高溫環境下，修飾后的產物半衰期最大可高達原枯草桿菌蛋白酶的15000倍。粒細胞多肽(human neutrophil peptides，HNP)是一種具有抗微生物活性和細胞毒性的多肽，其對胃癌細胞具有一定的毒性作用［27］。Linda 等［28］將人類嗜中性粒細胞肽(human neutrophil peptides，HNPs)序列中的精氨酸(Arginine)替換為鳥氨酸(Ornithine)，通過藥物代謝動力學研究發現168 h后仍有26%的經修飾后的HNP-Ornithine存在。

5 糖基化修飾

糖肽是指寡糖結構與多肽鏈中某些特殊氨基酸側鏈上的功能團以共價鍵的形式相連接的一類多肽類物質［29］。糖基化修飾是指多肽附加上糖類的這一過程。在多肽的固相合成中，最常用的為N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化通過天冬酰胺使側鏈的酰胺氮進行連接。O-糖基化是指多肽與絲氨酸或蘇氨酸殘基上的氧相連接［30-31］。

多肽藥物的糖基化修飾增加了側鏈的空間位阻，提高了多肽對酶的穩定性。如alglucosidase alfa(myozyme，shire)用于治療龐培氏病，按20 mg/kg(體質量)劑量，每2周注射1次［32］。darbepoetin alfa(aranesp，amgen)是促紅細胞生長素(erythropoietin，EPO)糖基化修飾后的產品，用于治療慢性腎功能衰竭及貧血，使用頻率從老一代EPO的每周2～3次降低至每周1次或每2周1次［33］。TY027是一種阿片受體拮抗劑，在大鼠血漿中的半衰期只有4.8 h。為了得到更加穩定的止痛劑，Takashi等［34］以TY027為原型進行糖基化修飾，引入一個 O-β-(Ser(Glc))，以 Fmoc-Ser(O-β-D-Glc(OAc)4)-OH為原料，通過Fmoc固相合成多肽法得到TY027糖基化的修飾產物，TY027及該修飾后產物結構如圖5所示。通過代謝穩定性實驗，在大鼠血漿中孵化24 h仍然有70%完整的該修飾產物能被檢測到。G.E.Umpierrez等［35］報道了LY2189265是一種新型的長效胰高血糖素(GLP-1)受體拮抗劑，用于治療Ⅱ型糖尿病。通過糖基化修飾，該藥物只需每周注射1次，大大提高了病人的依從性。

圖5 TY027及糖基化后產物結構比較

6 PEG修飾

聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)是由環氧乙烷聚合而成的大分子聚合物，結構式為HO-C(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH。PEG類修飾劑具有無毒、良好的溶解性和生物相容性、寬泛的相對分子量選擇范圍等優點。經PEG修飾后的多肽類藥物相對分子量有所增加，可降低腎小球的濾過效率，增強藥物對酶的穩定性，從而延長藥物在體內的半衰期［36］。

目前應用最普遍的PEG修飾劑是單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，結構為 CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH［37］。PEG修飾多肽類藥物時，為了使PEG能在較溫和的反應條件下與多肽偶聯，故需先將PEG活化，再將活化后的PEG與多肽肽鏈的C端、N端以及側鏈上的氨基、巰基和羧基進行偶聯［38］。

1990年，美國食品與藥品管理局(FDA)批準了第1個PEG修飾蛋白質類藥物pegademase(adagen，enzon)上市。pegademase是由聚乙二醇修飾的腺苷脫氨酶，用于治療嚴重的合并性免疫缺陷病癥，給藥頻率為每周1次，從給藥頻率上體現了修飾后藥物的長效性，減少了病人因頻繁給藥而帶來的痛苦［39］。到目前為止，已有多種經PEG修飾的蛋白質多肽類藥物獲FDA批準上市銷售，包括PEG修飾的天冬酰胺酶、重組人粒細胞集落刺激因子、干擾素等(表2)［40］。這些藥物在臨床應用中也體現出了PEG修飾的優勢。從給藥頻率不難看出PEG修飾在延長蛋白質多肽類藥物的半衰期上有顯著作用。目前還有大批的研究者致力于PEG修飾多肽類藥物的研究，也有很多新的PEG修飾藥物處于研發甚至臨床階段［41－43］。但PEG修飾劑本身的分散性造成了修飾后的藥物具有一定分散性，這會直接影響到產品的生物相容性、化學性能以及臨床功效等，這也是目前困擾PEG修飾的一大難點。解決途徑:①注重PEG的合成和純化，以保證PEG修飾劑本身的質量;②特異性定點修飾技術的應用以及對最佳反應條件的探索。

表2 FDA批準上市的PEG修飾蛋白多肽類藥物

7 結束語

據2010年調查，目前全世界市場銷售的多肽類藥物主要有51個品種，其中有6個品種在2008年銷售額超過了7.5億美元，總銷售額高達88.3億美元。但由于多肽在體內具有不穩定性、易被水解、易被腎臟清除等特性，使得多肽類藥物半衰期短，從而必須頻繁給藥，因此對多肽藥物的長效化研究顯得尤為迫切。化學修飾是多肽類藥物長效化技術中的常用方式，是藥物設計的重要手段。在目前的臨床應用中，通過化學修飾得到的長效多肽類藥物已顯現出其優良的性能。

在今后的研究中:一是對于藥物靶向性的研究，通過特異性的化學修飾實現藥物和病灶位點的特異性結合，使藥物在發揮更好藥效的同時，盡量降低對其他健康組織器官的傷害;二是將化學與生物方法相結合應用于多肽藥物長效化技術的探索，集兩者的優勢，共同開發新型的復合型長效化技術;三是尋找便于實現大規模工業化生產的化學修飾方法，使藥物從實驗室研究走向工業化生產及上市銷售，最終真正造福病人。

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