絲膠對(duì)糖尿病大鼠脊髓及脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞神經(jīng)生長因子表達(dá)的作用

趙曉麗 張延紅 張風(fēng)俠 王 冬 鐘美蓉陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

絲膠對(duì)糖尿病大鼠脊髓及脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞神經(jīng)生長因子表達(dá)的作用

趙曉麗 張延紅 張風(fēng)俠 王 冬 鐘美蓉1陳志宏1

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

目的 探討絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠脊髓及脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞神經(jīng)生長因子(NGF)表達(dá)的作用。方法 36只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組和絲膠治療組(n=12)。采用SP法觀察坐骨神經(jīng)對(duì)應(yīng)脊髓節(jié)段(L4～6)和脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF蛋白的表達(dá)。結(jié)果 NGF蛋白免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色細(xì)膩顆粒狀，位于脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和脊髓前角細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核，以胞質(zhì)為主。與正常對(duì)照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠脊髓前角細(xì)胞和脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.01);與糖尿病模型組大鼠比較，絲膠治療組大鼠脊髓前角細(xì)胞、脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。結(jié)論 絲膠上調(diào)脊髓前角細(xì)胞和脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF的表達(dá)，保護(hù)糖尿病坐骨神經(jīng)相關(guān)神經(jīng)元胞體。

絲膠;糖尿病;脊髓;脊神經(jīng)節(jié);NGF

當(dāng)前治療糖尿病周圍神經(jīng)病變大都以控制血糖為主，并輔以營養(yǎng)神經(jīng)及活血化瘀等藥物，但控制血糖的西藥的毒副作用不容忽視。蠶繭為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消。民間有蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方，本課題組的前期研究亦發(fā)現(xiàn)，絲膠可有效降低血糖、保護(hù)糖尿病腎臟損傷〔1〕。本研究探討絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)相關(guān)神經(jīng)元胞體的保護(hù)作用，為治療糖尿病周圍神經(jīng)損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 絲膠為彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成;鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司;兔抗NGF多克隆抗體，美國Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 健康清潔級(jí)3月齡雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量200～250 g(合格證號(hào):712024)，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)選取其中的12只作為正常對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理;其余的24只采用小劑量STZ連續(xù)腹腔注射(2%STZ，25 mg/kg，3 d)的方法建立2型糖尿病大鼠模型，以血糖≥16.7 mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)〔2〕;待模型成功建立后再隨機(jī)分為糖尿病模型組和絲膠治療組，糖尿病模型組大鼠不再做任何處理，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg－1·d－1)灌胃，連續(xù)35 d。

1.3 檢測(cè)血糖 各組大鼠用藥結(jié)束后禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥采血，離心后收集血清。應(yīng)用Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自動(dòng)臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖。

1.4 神經(jīng)生長因子(NGF)蛋白表達(dá)的檢測(cè)及定量分析 大鼠取血后斷頭處死，分別取坐骨神經(jīng)對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓(L4～6)和脊神經(jīng)節(jié)，入Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm。采用SP免疫組織化學(xué)染色法觀察脊髓前角細(xì)胞和脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF蛋白的表達(dá)。一抗稀釋濃度1:50，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照;以脊髓前角細(xì)胞和脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞核、胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒或棕褐色顆粒為NGF陽性反應(yīng)。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在10×20倍顯微鏡下對(duì)免疫組化陽性結(jié)果進(jìn)行定量分析，以免疫陽性產(chǎn)物面積占視野面積的比值作為NGF蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。每組隨機(jī)選取6只大鼠，每只大鼠選取6張切片，每張切片隨機(jī)選3個(gè)視野，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖 糖尿病模型組大鼠的血糖明顯高于正常對(duì)照組大鼠(P＜0.01)，絲膠治療組大鼠的血糖為明顯低于糖尿病模型組大鼠(P＜0.01)。見表1。

2.2 大鼠脊髓前角細(xì)胞、脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF蛋白的表達(dá)NGF蛋白免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色細(xì)膩顆粒狀，位于脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和脊髓前角細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核，以胞質(zhì)為主(圖1);NGF蛋白定量分析結(jié)果見表1。與正常對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠脊髓前角細(xì)胞和脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。與模型組大鼠比較，絲膠治療組大鼠脊髓前角細(xì)胞和脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。

表1 各組大鼠血糖、脊髓前角細(xì)胞和脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF的表達(dá)(±s，n=12)

表1 各組大鼠血糖、脊髓前角細(xì)胞和脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF的表達(dá)(±s，n=12)

糖尿病模型組:1)P＜0.01

組別 血糖(mmol/L) NGF表達(dá)脊髓前角細(xì)胞 脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞正常對(duì)照組 10.83±2.031) 0.118 5±0.023 81) 0.411 8±0.035 31)糖尿病模型組 29.45±4.82 0.040 8±0.006 9 0.217 6±0.031 9絲膠治療組 13.20±4.01) 0.086 7±0.020 31) 0.295 2±0.052 21)

圖1 各組大鼠脊髓前角及脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NGF的表達(dá)(DAB，×200)

3 討論

目前，糖尿病周圍神經(jīng)病變的機(jī)制尚不十分明了，研究發(fā)現(xiàn)多種因素參與了糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病過程〔3〕:體內(nèi)多元醇代謝通路活性增強(qiáng)，醛糖還原酶活性明顯提高，多元醇在細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，導(dǎo)致蛋白激酶-C和Na+-K+-ATP酶活性降低，Na+在神經(jīng)纖維間滯留，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢;神經(jīng)組織缺血、缺氧或過氧化;微管、微絲及神經(jīng)結(jié)構(gòu)蛋白的非特異性糖基化;神經(jīng)營養(yǎng)因子及其他生長因子相對(duì)缺乏。上述因素與糖尿病微血管病變相互作用，形成“惡性循環(huán)”，導(dǎo)致雪旺氏細(xì)胞代謝紊亂，神經(jīng)纖維節(jié)段性脫髓鞘，嚴(yán)重者神經(jīng)纖維萎縮變性。

由靶細(xì)胞合成釋放的NGF通過旁分泌的方式與神經(jīng)末梢上的高親和力受體(TrKA)和低親和力受體(p75)結(jié)合，通過軸漿逆行運(yùn)輸至胞體，發(fā)揮誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)、抑制神經(jīng)元凋亡、誘導(dǎo)軸突生長、促進(jìn)神經(jīng)鞘磷脂水解和神經(jīng)纖維再生等多種功能〔4〕。關(guān)于NGF與糖尿病周圍神經(jīng)損傷之間的關(guān)系，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)無論是糖尿病患者還是糖尿病動(dòng)物模型，多種組織均出現(xiàn)NGF表達(dá)水平下降，原因可能與胰島素缺乏和高血糖狀態(tài)使NGF合成減少、受體(TrKA)親和力降低及NGF逆向軸漿運(yùn)輸受損有關(guān)〔5〕。

糖尿病周圍神經(jīng)病變?cè)谔悄虿〉幕A(chǔ)上發(fā)展而來，以臟腑陰虛燥熱、氣陰兩虛、津液疏布失常為基礎(chǔ)，隨著病程的延長，日久導(dǎo)致癖血阻滯經(jīng)絡(luò)，出現(xiàn)肢體疼痛、麻木等諸多表現(xiàn)。民間有蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方。一根繭絲由兩根單絲纖維平行黏合而成，每根單絲又由中心絲素和外圍絲膠構(gòu)成。起源于我國的蠶絲業(yè)擁有幾千年的悠久歷史，但對(duì)蠶絲的應(yīng)用主要集中于絲素方面，絲膠約占繭絲的30%，在繅絲和精練時(shí)極大部分作為廢料而丟棄。絲膠為天然高分子水溶性蛋白，由18種氨基酸組成，以絲氨酸、天冬氨酸和谷氨酸為主。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型組大鼠脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和脊髓前角細(xì)胞NGF的表達(dá)明顯低于正常組大鼠，這與前人的研究結(jié)果一致。絲膠治療組大鼠脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和脊髓前角細(xì)胞NGF的表達(dá)較模型組明顯上調(diào)，表明絲膠可通過降低血糖，增加靶細(xì)胞NGF的合成，提高NGF受體親和力，促進(jìn)軸漿運(yùn)輸?shù)龋l(fā)揮對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的保護(hù)作用。

1 宋成軍，郝祥俊，陳志宏.絲膠對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能和腎臟TIMP-1表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(15):2157-9.

2 Xiang X，Wang Z，Zhu Y，et al.Dosage of streptozocin in inducing rat model of type 2 diabetes mellitus〔J〕.Wei Sheng Yan Jiu，2010;39(2):138-42.

3 Zochodne DW.Diabetic neuropathies:features and mechanisms〔J〕.Brain Pathol，1999;9(2):369-91.

4 Hannila SS，Kawaja MD.Nerve growth factor-mediated collateral sprouting of central sensory axons into differentiated regions of the dorsal horn is enhanced in the absence of the p75 neurotrophin receptor〔J〕.J Comp Neurol，2005;486(4):331-43.

5 Kanbayashi H，Itoh H，Kashiwaya T，et al.Spatial distribution of nocieptive neuropeptide and nerve grow the factor depletion in experimental diabetic peripheral nervous system〔J〕.J Int Med Res，2002;30(5):512-9.

〔2011-08-23收稿 2011-12-12修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

Effects of sericine on nerve growth factor expressions in anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells

ZHAO Xiao-Li，ZHANG Yan-Hong，ZHANG Feng-Xia，et al.
Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，Hebei，China

Objective To investigate the effects of sericine on nerve growth factor(NGF)expressions in anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells.Methods 36 male SD rats were randomly divided into normal control，diabetes model and sericine treatment groups(n=12).SP immunohistochemical staining was used to observe the NGF protein expressions in anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells.Results NGF protein immunopositive products were buffy exquisite granules，located at the cytoplasm and nucleus of anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells，mainly at cytoplasm.Compared with normal control rats，the NGF expressions in anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells of rats in diabetes model group were decreased significantly(P＜0.01).Compared with diabetes model rats，the NGF expressions in anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells of rats in sericine treatment group were increased obviously(P＜0.01).Conclusions Sericine can protect sciatic nerve correlated neuronal soma of type 2 diabetes rats by up regulating NGF expressions in anterior horn cells of spinal cord and sciatic nerve.

Sericine;Diabetes mellitus;Spinal cord;Spinal ganglia;Nerve growth factor

R587

A

1005-9202(2012)17-3700-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.041

河北省教育廳項(xiàng)目(No.2006301);河北省科技廳項(xiàng)目(No.08276101D-9)

1 承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室

陳志宏(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)解剖學(xué)研究。

趙曉麗(1964-)，女，副主任護(hù)師，主要從事神經(jīng)電生理學(xué)研究。